泡桐丛枝植原体致病相关基因分子特征及其编码蛋白功能研究

摘要

泡桐(Paulownia sp.)是我国重要的阔叶树种之一，泡桐丛枝病(Paulownia witches'broom disease)在我国发生普遍，是由泡桐丛枝植原体(Paulownia witches' broomphytoplasma)引起的侵染性病害，表现为腋芽和不定芽大量萌发至簇生成团，有些病树上会出现花变叶症状，常常不能正常开花结实。为了深入了解植原体致病机理，本文通过植原体致病相关基因的克隆、原核表达、抗血清制备、蛋白活性测定、瞬时表达与病症分析等方法，对植原体致病基因的功能进行研究和分析，发现tRNA-ipt基因可能影响了植物细胞的分裂和增长，这为植原体致病分子机制提供了新的思路和线索。
　　 本研究用PCR方法在我国四种16SrI组植原体中克隆到tRNA异戊烯基焦磷酸转移酶基因(tRNA-ipt)，并对其全长序列进行生物信息学分析，发现泡桐丛枝(Paulowniawitches' broom，PaWB)、桑萎缩（Mulberry dwarf，MD）、长春花绿变(periwinkle virescence，PeV)及苦楝丛枝（Chinaberry witches' broom，CWB）植原体的tRNA-ipt基因的开放读码框长度均为876bp，G+C含量分别为30％、29.5％、29.5％和29.3％;它们均编码291个氨基酸的蛋白，预测分子量均为33kDa。四种植原体的IPT蛋白N端皆含有ATP/GTP结合相关序列(GPTASGKT)。预测该蛋白无跨膜区，分布在细胞质中。四种植原体的tRNA-IPT之间的氨基酸序列相似性为99.1％-99.5％，与同组植原体蛋白相似性为95.4％-99.3％，与其他组植原体低于70％;系统进化分析显示，所有已知9个植原体tRNA-IPT共聚为一大支，且与无胆甾原体遗传关系更近。
　　 对泡桐丛枝植原体tRNA-ipt基因进行原核表达并制备抗体。利用Western blot和FITC间接免疫荧光显微镜检测其在植原体中的表达。使用分光光度计分析该基因对大肠杆菌生长的影响，用ELISA测定转化菌株细胞分裂素含量。SDS-PAGE结果显示tRNA-IPT蛋白在大肠杆菌中得到表达。首次获得泡桐丛枝植原体tRNA-IPT抗体并检测到该蛋白在泡桐发病组织中的特异表达。经过对转化菌株生长曲线及玉米素含量的测定，发现该基因能促进大肠杆菌后期生长和玉米素核苷的积累。结果表明泡桐丛枝植原体tRNA-IPT蛋白能够在植原体中表达，根据该基因对异源菌株生长速率和激素合成的影响推断该蛋白可能参与植原体的细胞分裂素合成，并在致病过程中起到重要作用。
　　 构建病毒表达载体pCAPE-ipt，转化农杆菌，注射浸润健康泡桐组培苗叶片，使植物细胞表达tRNA-IPT蛋白。结果显示感染pCAPE-ipt的泡桐离体叶片可以保持较长的生长和存活时间;感染pCAPE-ipt的泡桐植株，两周后开始长出腋芽，与泡桐丛枝病早期症状极为相似。同时Western blot证实tRNA-IPT已在植物中表达。根据此结果推测，tRNA-IPT蛋白可能影响寄主植物激素平衡，从而导致丛枝病，这为植原体致病分子机制提供了新的线索。
　　 根据已发表植原体质粒序列设计引物，经两次PCR扩增，获得大小不同的两段DNA片段，测序后拼接得到了4种完整的环状质粒，分别是桑树萎缩植原体濮阳株系质粒(pMDPy)、长春花绿变植原体海南株系质粒(pPeVHn)、泡桐丛枝植原体山东株系质粒(pPaWBG33D)及苦楝丛枝植原体福清株系质粒(pCWBFq-2)，其中pMDPy为首次测定，其质粒全长分别为3833bp、3943bp、3843bp和3913bp，4种质粒皆编码5个蛋白，ORF1和ORF5分别编码复制相关蛋白(RepA)和单链DNA结合蛋白(SSB)，ORF2-4编码未知功能蛋白。4种质粒序列的非编码区分析表明，ORF1和ORF2之间的非编码区存在启动子和核糖体结合位点。将4种植原体质粒全序列与GenBank中登录的植原体质粒进行序列相似性比对和系统进化分析，结果表明这4种质粒与其它16SrI组的质粒聚为一个大的分支，与16S rDNA系统发育树基本一致。此研究为进一步深入了解不同植原体质粒的结构与功能、寄主专化性和质粒基因变异及进化奠定了基础，也为基于多基因分类鉴定提供新的理论依据。
　　 本研究首次在泡桐丛枝植原体中获得胸苷酸激酶基因(tmk)，并在4个地区不同品种感病泡桐中检测到不同tmk基因。以PaWB-G33D、PaWB-JAN、PaWB-PS和PaWB-BJ株系侵染的泡桐总DNA为模板，扩增并克隆了tmk基因。分别由591、600、639和588个核苷酸组成。基因序列比对结果显示，泡桐丛枝植原体与16SrI组的其它几种植原体tmk基因相似性均大于90％。不同地区和不同品种泡桐tmk基因各有不同，这体现出在泡桐丛枝植原体中存在着tmk基因丰富的遗传变异和多样性种群。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 植原体概述

1．1．1 植原体的发现及危害

1．1．2 植原体的侵染途径

1．1．3 植原体的分类

1．1．4 植原体检测技术

1．2 植原体基因组和功能基因研究进展

1．2．1 植原体染色体基因组学和功能基因组学研究

1．2．2 相关基因功能研究技术原理及发展

1．2．3 植原体染色体外DNA(质粒)研究进展

1．2．4 植原体胸苷酸激酶基因(tmk)研究进展

1．3 植原体与寄主植物互作关系

1．4 植原体致病机制的研究

1．4．1 植原体侵染引起的典型症状类型

1．4．2 与植原体致病相关的代谢途径

1．4．3 与植原体致病相关的基因功能与调控研究

1．5 激素与植物病害的关系

1．5．1 植物激素类型与生物学功能

1．5．2 病菌导致激素紊乱及致病机制

1．5．3 植物和微生物细胞分裂素代谢途径及代谢基因表达与调控

1．6 植原体致病机制研究中存在的问题

1．7 本研究的目的及意义

1．8 本研究技术路线

第二章 植原体tRNA-ipt基因的克隆及分子特征

2．1 材料和方法

2．1．1 材料

2．1．2 总DNA的提取

2．1．3 序列扩增与测定

2．1．4 序列比对和蛋白质特征预测

2．2 结果和分析

2．2．1 植原体tRNA-ipt基因的PCR扩增

2．2．2 植原体tRNA-ipt基因和编码蛋白氨基酸序列分析

2．2．3 PawB-IPT蛋白结构分析

2．2．4 PawB-IPT蛋白的亚细胞定位

2．2．5 PawB-IPT蛋白二级结构预测

2．2．6 PaWB-IPT蛋白三级结构预测

2．2．7 tRNA-IPT蛋白的motif分析

2．3 讨论

第三章 植原体tRNA-ipt基因的原核表达及在感病泡桐中的检测

3．1 材料和方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 原核表达载体的构建

3．2．2 tRNA-IPT对转化大肠杆菌生长速率及细胞分裂素(玉米素)产生的影响

3．2．3 原核表达产物的分析

3．2．4 Western blot验证

3．2．5 tRNA-IPT蛋白在植物中的表达

3．2．6 间接免疫荧光显微镜观察

3．2．7 抗血清的制备及ACP-ELlSA检测

3．3 讨论

第四章 tRNA-ipt在pCAME病毒表达载体的构建

4．1．材料和方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果

4．2．1 病毒表达载体的构建

4．2．2 注射重组病毒载体后离体叶片表型变化

4．2．3 注射重组病毒载体后健康泡桐植株腋芽表型变化

4．2．4 Western Blot验证

4．3 讨论

第五章 16SrI组植原体四个质粒的测定与分子特征

5．1 材料和方法

5．1．1 材料

5．1．2 方法

5．2 结果与分析

5．2．1 质粒片段的PCR扩增与序列测定

5．2．2 四种植原体质粒的序列分析

5．2．3 四种植原体编码的蛋白质比较

5．2．4 质粒DNA全序列和单基因的系统进化分析

5．2．5 质粒非编码区序列分析

5．3 讨论

第六章 泡桐丛枝植原体tmk基因的克隆与序列分析

6．1 材料和方法

6．1．1 材料

6．1．2 总DNA的提取

6．1．3 序列扩增与测定

6．2 结果和分析

6．2．1 植原体tmk基因的PCR扩增

6．2．2 植原体tmk基因序列分析

6．3．结论与讨论

第七章 结论与展望

7．1 结论

7．2 展望

参考文献

附录：缩略词表

在读期间的学术研究

致谢