泡桐丛枝植原体中国株系的分子鉴定及免疫膜蛋白基因表达研究

摘要

泡桐丛枝病(Paulownia witches'broom，)由泡桐丛枝植原体(Paulownia witchesphytoplasma)侵染引起，该病遍布我国各泡桐栽培区，分布于陕西、河北、山东、河南、安徽、湖南、湖北、江苏、浙江、江西等地，严重地区发病率达80％以上，是泡桐生产上最重要的病害之一。据1990年统计，全国丛枝病发生面积达88万公顷，直接造成的经济损失超过亿元。因此，对泡桐丛枝病防治的研究是泡桐生产中长期亟待解决的问题。 由于植原体在寄主体内含量低，又无法进行分离培养，致使对该病原物的研究受到了一定的限制，因此，本文用分子生物学方法对泡桐丛枝植原体进行了分子生物学检测，分离和克隆了与致病有关的免疫膜蛋白基因。研究结果如下： (1)用分子生物学方法对采自全国六个省区自然发病的泡桐丛枝病植株进行植原体16S rDNA基因片段和延伸因子(EF-Tu)tuf基因的扩增，将所得序列进行同源性比较，结果表明，我国大陆泡桐主栽区陕西、山西、甘肃、河南、河北、山东各省与已经报道的台湾省泡桐丛枝植原体基本一致，均为同一个种，没有株系的分化，全部归属于植原体16S r I-D组。16S rDNA和tuf基因的序列均已提交GenBank，序列登录号依次为DQ851169和DQ851170。 (2)根据已发表的洋葱黄化植原体全基因组序列设计特异性引物，从泡桐丛枝植原体中分离并克隆了免疫抗原膜蛋白Amp基因(PaWB-amp)，其长696bp，GC含量为32.5％，编码231个氨基酸。所测序列已被Genbank收录，登录号为DQ515794。对泡桐丛枝．陕西株系(PaWB．Shaanxi)、翠菊黄化(AY)和洋葱黄化(OY)植原体Amp核苷酸序列进行比较，同源性达98.39％。利用ANTHEPROT5.0软件对PaWB-amp进行分析，可知该蛋白的分子量为24.7KDa，具有良好的抗原性。二级构象中，螺旋形式占73％，折叠占11％，其余为无规则卷曲占16％，无转角形式。具有两个跨膜区，存在有多个潜在信号肽切割位点，其中末端的第219个氨基酸(甘氨酸)处为最强切割位点，在该蛋白的中部未发现潜在的信号肽切割位点。本试验为进一步研究该蛋白的功能奠定了理论基础，并期望以此为基础揭示植原体的致病机理。 (3)分别构建了含有目的基因的原核表达重组质粒pET30-amp、pET30-amp603和pBV221-amp603，转化表达宿主菌培养，在不同条件下诱导后，经SDS-PAGE，结果均未能出现该蛋白的表达条带。说明PaWB-amp对大肠杆菌具有毒性。构建了真核表达载体pPIC9K-AMP，经PCR、酶切和测序鉴定，该序列插入pPIC9K真核表达载体，方向正确。尽管本试验未能将泡桐丛枝植原体．Amp基因表达成功，但是这为植原体的免疫主导膜蛋白具有可变性及多样性的观点提供了又一个证据。

目录

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第一章文献综述

1.1泡桐丛枝病的研究现状

1.1.1发生和危害

1.1.2症状

1.1.3病原学研究

1.1.4传播途径

1.1.5检测技术

1.1.6病害发生规律、发病机理及发病因素

1.1.7防治技术

1.2泡桐丛枝植原体相关基因研究进展

1.2.1保守序列

1.2.2免疫膜蛋白基因

1.3本研究的目的意义和技术路线

第二章泡桐丛枝植原体16S rDNA和延伸因子(EF-Tu)tuf基因的序列分析

2.1试验材料

2.1.1供试材料

2.1.2仪器

2.1.3菌种、质粒和试剂

2.1.4溶液配置

2.2试验方法

2.2.1泡桐总DNA的提取

2.2.2 PCR扩增

2.2.3目的片段的克隆

2.2.4重组质粒的鉴定

2.2.5目的片段的序列测定和同源性分析

2.3结果与分析

2.3.1 DNA的提取

2.3.2 PCR扩增结果

2.3.3目的片段的序列测定和同源性分析

2.4讨论

第三章泡桐丛枝植原体免疫膜蛋白(Amp)基因的序列分析与结构预测

3.1试验材料

3.1.1供试材料

3.1.2菌种、质粒和试剂

3.2试验方法

3.2.1泡桐总DNA的提取

3.2.2 PaWB-Shaanxi免疫膜蛋白(Amp)基因的分离

3.2.3目的片段的克隆

3.2.4重组质粒的鉴定

3.2.5目的片段的序列测定、同源性分析及结构预测

3.3结果与分析

3.3.1 PCR扩增及重组质粒鉴定结果

3.3.2目的片段的序列测定和同源性分析

3.3.3 PaWB-Shaanxi免疫膜蛋白(Amp)的生物信息学分析

3.4讨论

第四章泡桐丛枝植原体amp基因的体外表达

4.1试验材料

4.1.1供试材料

4.1.2菌种与载体试剂

4.1.3 SDS-PAGE所需溶液配制

4.2试验方法

4.2.1 PaWB-amp基因在大肠杆菌中的原核表达

4.2.2 PaWB-amp部分基因的原核表达

4.2.3 pPIC9K-AMP真核表达载体构建

4.3结果与分析

4.3.1 PaWB-amp基因的扩增及重组质粒鉴定结果

4.3.2 PaWB-amp部分基因的扩增及重组质粒鉴定结果

4.3.3 PaWB-amp基因在大肠杆菌中的诱导表达

4.3.3 pPIC9K-AMP重组质粒的鉴定

4.4讨论

第五章结论与研究设想

5.1主要结论

5.2进一步的研究设想

参考文献

致谢

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