垂丝海棠响应盐碱胁迫的生理特性及基于转录组学分析的MhPR1功能基因验证

摘要

苹果(Malus domestica Borkh)是中国西北黄土高原区重要的农村支柱性产品,但该产区土壤多盐碱化,限制了苹果产业发展。生产发现,优良砧木既可控制树体结构,还能提高树体的抗逆性,故选择抗性强的砧木可缓解土壤盐碱化对其品种产生的不利影响。本试验以甘肃干旱盐碱生境的垂丝海棠(M.halliana Koehen)(CS)的1年生幼苗为试材和原产于东北吉林的1年生山定子(M.baccata(Linn.)Borkh.)(SDZ)为对照,采用100 mmol·L-1的Na Cl和Na HCO3(按摩尔比Na Cl:Na HCO3=1:1)(p H 8.2)模拟盐碱生境,设置3种不同的胁迫处理方式,即盐胁迫(SS)(p H 7.0)、碱胁迫(AS)(p H 9.0)、盐碱复合胁迫(MAS)(p H 8.2)。通过测定光合荧光参数,观察解剖特征,揭示垂丝海棠响应3种胁迫的生理特性,并以垂丝海棠组培苗为试材,筛选转录组学关键时间点,进行RNA-seq分析,分析主要代谢通路中的关键差异基因进行功能验证。主要研究结果如下:1.SS、AS和MAS 3种胁迫对垂丝海棠和山定子砧木的光合荧光和解剖结构的抑制差异显著,效果不一。其中对垂丝海棠生长的抑制作用表现为MAS>AS>SS,而对山定子生长的的抑制作用为:AS>MAS>SS。SS下,垂丝海棠和山定子通过启动热耗散机制来缓解胁迫;AS下,垂丝海棠可提高热耗散能力,避免过剩光能造成损伤,实现光保护;而山定子光保护机制被严重损坏,失去自我保护能力,这与AS引起的高p H破坏光合系统有关。2.MAS对两种砧木具有盐和碱的协同效应。山定子在MAS下,光保护机制明显受损,而垂丝海棠在MAS前期利用热耗散机制可保护光合系统,后期保护机制被严重损坏。3.两种砧木响应三种胁迫的解剖特性是不一致的,相比山定子,垂丝海棠在SS下通过发达的栅栏组织而提高植株的光合性能;AS下,高p H严重破环了山定子的木质部,而垂丝海棠通过发达的木质部降低了导管密度,提高植株的耐性;MAS下,山定子木质化程度严重,而垂丝海棠根系通过改变维管柱结构应答胁迫。4.在盐碱胁迫第4 d时,对垂丝海棠的叶片进行转录组学分析,共鉴定出16,246个DEGs,其中上调7268个,下调8978个。这些差异表达基因主要富集通路有:钙信号、碳代谢、植物激素信号传导、氨基酸合成、次级代谢物合成等过程。5.转录组学和实时荧光定量PCR共同分析显示,在盐碱胁迫下,植物激素信号传导的水杨酸信号通路中病程相关蛋白PR1基因(pathogenesis-related proteins,PRs)表达量显著。为此克隆得到苹果属垂丝海棠MhPR1基因,其片段大小为486 bp,相对分子质量为17.27 KD;氨基酸的数量为161;正负电荷残基数分别为16、12;不稳定系数为24.39,说明该蛋白是稳定的亲水性蛋白。系统进化树结果显示,苹果属垂丝海棠MhPR1与白梨亲缘关系最相近。6.对MhPR1基因构建过表达载体,用农杆菌介导法对MhPR1基因遗传转化拟南芥、烟草和苹果愈伤组织,成功获得转基因材料。过量表达MhPR1基因增强了转基因拟南芥和烟草对盐碱胁迫的耐性,过表达苹果愈伤组织在盐碱胁迫处理时通过提高抗氧化酶活性而缓解胁迫。

目录

摘要

SUMMARY

缩略词

第一章 文献综述

1 研究背景

2 盐碱胁迫对植物的影响

3 植物响应盐碱逆境的生理特性

4 植物响应盐碱胁迫的分子机理

5 病程相关蛋白基因(pathogenesis-related proteins,PRs)的研究进展

6 研究目的及意义

第二章 苹果砧木响应盐、碱及盐碱复合胁迫的生理特性

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 盐、碱及盐碱复合胁迫处理

1.3 测定指标及方法

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 垂丝海棠和山定子响应盐、碱及盐碱复合胁迫的光合特性

2.2 垂丝海棠和山定子响应盐、碱及盐碱复合胁迫的荧光特性

2.3 垂丝海棠和山定子响应盐、碱及盐碱复合胁迫的显微结构变化

2.4 垂丝海棠和山定子响应盐、碱及盐碱复合胁迫的综合评价

3 讨论

第三章 垂丝海棠幼苗响应盐碱胁迫的转录组学分析

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验指标测定

1.3 数据分析

2 结果与分析

2.1 盐碱胁迫对垂丝海棠的表型及叶片组织化学染色

2.2 盐碱胁迫对垂丝海棠抗氧化酶活性的影响

2.3 垂丝海棠叶片响应盐碱胁迫的转录谱分析

2.4 盐碱胁迫相关基因的GO分析

2.5 差异基因KEGG富集

2.6 盐碱胁迫下垂丝海棠叶片钙信号相关的DEGs分析

2.7 盐碱胁迫响应植物激素信号转导相关的DEGs分析

2.8 关键代谢物合成途径相关的DEGs分析

2.9 DEGs的实时荧光定量验证

3 讨论

第四章 苹果属垂丝海棠 MhPR1 基因的克隆及功能鉴定

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 菌株和载体

2 试验方法

2.1 MhPR1(pathogenesis-related proteins,PRs)基因的克隆及生物信息学分析

2.2 实时荧光定量PCR分析

2.3 植物表达载体构建及农杆菌LBA4404 转化

2.4 pRI101-MhPR1 菌液的准备

2.5 转基因烟草的获得

2.6 转基因拟南芥的获得

2.7 过表达苹果愈伤组织的的获得

2.8 生理指标的测定

2.9 数据分析

3 结果与分析

3.1 MhPR1 基因克隆及表达载体的构建

3.2 目的基因表达载体的构建

3.3 MhPR1 编码蛋白序列与结构分析

3.4 系统进化树分析

3.5 MhPR1 启动子顺式作用元件分析

3.6 转基因烟草、拟南芥和过表达苹果愈伤组织的筛选与鉴定

3.7 在盐碱胁迫下MhPR1 转基因拟南芥的形态特征和生理指标测定

3.8 在盐碱胁迫下转基因MhPR1 烟草的形态特征和生理指标测定

3.9 在盐碱胁迫下过表达MhPR1 基因苹果愈伤的形态特征和生理指标测定

4 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

作者简介

在读期间发表论文和研究成果等

导师简介