毛竹miR164b及其靶基因PeNAC1的克隆与功能研究

摘要

非生物逆境胁迫是影响植物生长发育以及生物产量的主要因素之一，为适应环境植物形成了一套内在的自身调节机制，其中miRNA主要通过剪切降解靶基因或者抑制其翻译达到调控的目的。miR164家族是植物特有的，其中miR164b主要的靶标基因是编码NAC的转录因子，NAC参与调控植物生长发育过程以及对高盐、干旱等非生物逆境胁迫响应过程。因此，研究miR164及其靶基因NAC的功能对于揭示二者之间的调控方式及其在抗逆过程中的作用具有重要意义。本文以毛竹（Phyllostachys edulis）为研究对象，分离了毛竹ped-miR164b相关序列和靶基因PeNAC1序列，在分析基因结构特点的基础上，通过RLM-5'RACE技术验证ped-miR164b对PeNAC1的作用位点，分析二者的表达模式，通过转基因技术验证其功能，为今后竹子抗逆分子育种提供参考依据，主要结果如下:
　　(1)基因序列的获得及生物信息学分析
　　从毛竹数据库（BambooGDB，www.bamboogdb.org）中获得miR164家族两个成员，分别为ped-miR164a和ped-miR164b。根据ped-miR164b前体序列(PH01000543)设计特异性引物进行扩增，得到前体序列82 bp，二级结构预测结果表明该序列可形成稳定的茎环结构，且对应成熟序列（5'-UGGAGAAGCAGGGCACGUGCU-3'）位于5'端臂上。ped-miR164b成熟序列保守性较高，与其它植物miR164家族成熟序列标准序列仅相差于最后一个碱基序列(A→U)。
　　以玉米（Zea mays）Zm NA C1为诱饵，在毛竹全长cDNA数据库中搜索获得同源基因序列(FP095491)，特异性扩增获得其ORF序列，长度为867 bp，编码一个288个氨基酸的蛋白。序列分析表明，在ORF的3'端包含与miR164b相匹配的靶点序列（5'-AGCAAGTGCCCTGCTTCTCCA-3'）; ORF编码的蛋白与拟南芥（Arabidopsisthaliana）、水稻（Oryza sativa）、玉米的NAC1具有较高的相似度（94％以上），包含NAC1特有的A、B、C、D和E五个蛋白结构域，因此将该基因命名为PeNAC1。
　　(2)切割位点验证分析
　　采用RLM-5'RACE技术，验证ped-miR164b对其靶基因PeNAC1的切割作用。结果表明:PCR产物进行回收测序发现10个样品中有9个的剪切位点在靶点序列的第10-11位碱基之间，说明ped-miR164b可在转录水平对其靶基因PeNAC1进行切割，调控其表达。这与在玉米中miR164对其靶基因ZmNA C1的切割位点相一致，进一步证明植物miR164切割位点的保守性。
　　(3)基因时空表达分析
　　采用实时定量PCR方法对ped-miR164b及PeNAC1进行组织特异性表达分析，结果表明，二者均在根、茎、叶和鞘中表达，为组成型表达，且ped-miR164b在根中表达量最高，而PeNAC1则在根中表达量最低。实时定量PCR结果表明，NaCl(300 mmol·L-1)、低温(4℃)和强光(1500μmol·m-2·s-1)处理后毛竹叶片中ped-miR164b的表达均下调，GA3(100μmol·L-1)处理后ped-miR164b表达量则上调，而在同样处理条件下，PeNAC1的表达恰好呈现出与其完全相反的趋势。由此表明，ped-miR164b及其靶基因PeNAC1可能响应植物抗逆及激素信号转导过程。
　　(4)基因异位表达及转基因植株表型分析
　　分别构建ped-miR164b前体的过量表达载体以及PeNAC1的正、反义植物表达载体，转化模式植物拟南芥。结果表明，转ped-miR164b的拟南芥植株子叶或者叶柄发生不同程度的融合，有的子叶则发育形成杯状，有的莲座叶发育不正常，如出现非对称子叶、缺刻叶片、不规则叶片，有的根系生长明显受到抑制，侧根数量减少。转正义PeNAC1的拟南芥植株，相对野生型植株，生长较快，侧根数目相对较多;而转反义PeNAC1的植株则生长相对较慢，个体矮小，有的株系则出现与转ped-miR164b植株相似的表型，即缺叶或者非对称叶表型，同时侧根数目也相对较少，有的株系根长度变短。
　　(5)转基因植株抗逆性分析
　　分别对转基因植株进行NaCl（300 mmol·L-1）和PEG6000(30％)处理，以野生型拟南芥为对照，统计成活率，同时进行叶绿素荧光参数测定。结果表明，转正义PeNAC1基因的转基因植株成活率达到80-90％，荧光参数Fv/Fm下降趋势较缓慢;而过表达ped-miR164b和转反义PeNAC1基因的转植株成活率为20-30％，荧光参数Fv/Fm下降趋势较快。由此表明，ped-miR164b及靶基因PeNAC1可能通过影响转基因植株根的发育进而影响其抗性。
　　(6)ped-miR164b前体上游启动子序列分离及活性分析
　　经过特异性扩增获得ped-miR164b前体上游启动子区域序列(1，480bp)，通过在线平台Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/Webtools/plantcare/html/）分析结果表明，此序列包含启动子基本作用元件，如TATA-box、CAAT-box等，此外还包括许多和逆境相关的响应元件，如ARE、LTR和MBS等，这说明ped-miR164b可能参与调控植物逆境胁迫过程。构建该启动子区域序列与GUS基因融合的表达载体，将其转入模式植物拟南芥，通过筛选抗性植株，进行GUS组织化学染色。结果表明，转基因植株的根、茎和叶中均呈现蓝色，表明该启动子能够调控GUS报告基因的表达，具有生物活性，且为组成型启动子。
　　MiR164家族和NAC转录因子家族均是植物特有的，本研究结果表明ped-miR164b及PeNAC1都是组成型表达，参与激素和非生物胁迫条件的应答调节。在模式植物拟南芥中过量表达ped-miR164b及PeNAC1，均影响转基因植株叶及根的形态建成。在干旱、盐胁迫条件下，ped-miR164b和PeNAC1转基因植株的生理指标测定结果证明ped-miR164b和PeNAC1在干旱、盐胁迫过程中具有重要的调控作用，这为进一步开展竹子抗逆分子育种提供了基因资源。

目录

声明

摘要

缩略表

第一章 绪论

1．1 引言

1．1．1 研究的目的与意义

1．1．2 国内外研究现状及发展趋势

1．2 研究目标与主要研究内容

1．2．1 关键的科学问题与研究目标

1．2．2 主要研究内容

1．3 技术路线图

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料及生长环境

2．1．2 实验载体及菌株

2．1．3 主要试剂

2．1．4 培养基的配制

2．1．5 实验仪器

2．1．6 引物设计

2．2 实验方法

2．2．1 毛竹基因组DNA及总RNA的提取

2．2．2 反转录

2．2．3 ped-miR164b相关基因序列克隆

2．2．4 ped-miR164b介导靶基因的切割位点验证

2．3 生物信息学分析

2．4 半年生毛竹实生苗逆境胁迫及激素处理

2．5 定量分析

2．6 植物表达载体构建及转化

2．6．1 目的基因扩增

2．6．2 植物表达载体构建及检测

2．6．3 重组质粒转化农杆菌GV3101

2．6．4 转化模式植物拟南芥

2．6．5 转基因拟南芥PCR检测验证

2．7 转基因拟南芥功能验证

第三章 结果与分析

3．1 ped-miR164相关基因的克隆

3．1．1 毛竹叶片基因组DNA的提取及总RNA的提取

3．1．2 ped-miR164b前体序列及其成熟序列克隆

3．1．3 ped-miR164b靶基因PeNAC1编码区扩增

3．1．4 ped-miR164b前体上游启动子序列扩增

3．1．5 RLM-5’RACE剪切位点的预测及验证

3．2 生物信息学分析

3．2．1 ped-miR164b前体及成熟序列分析

3．2．2 毛竹NAC转录因子家族及miR164b作用位点分析

3．2．3 ped-miR164b前体上游序列调控元件分析

3．3 基因表达分析

3．3．1 组织特异性表达分析

3．3．2 胁迫及激素处理表达分析

3．4 基因异位表达及启动子活性分析

3．4．1 ped-miR164b基因植物表达载体构建及菌液PCR验证

3．4．2 PeNAC1正、反义植物表达载体构建及菌液PCR验证

3．4．3 转基因拟南芥PCR检测

3．4．4 转基因拟南芥植株表型分析

3．4．5 GUS组织化学染色及活性分析

3．4．6 转基因拟南芥植株抗逆性分析

第四章 结论与讨论

4．1 结论

4．2 讨论

4．3 展望

参考文献

在读期间的学术研究

致谢