核桃复幼促进扦插生根的多激素作用机制

摘要

核桃（Juglans L.）产业化的必经之路是实现良种无性繁殖，扦插是木本植物主要的繁殖方式，而核桃属于难生根植物，尤其采用栽培品种和成龄植株为试材时不定根发生极难，这一现象对许多经济林树种而言具普遍性。在前人研究基础上，本实验室经过多年试验，采用嫁接和埋干黄化等措施将成龄插穗复幼，成功地诱导了核桃等许多难生根木本植物不定根发生。但目前针对复幼处理促进不定根发生能力的生理机制研究，特别是关于不定根发生的关键调控因素——植物内源激素和外源生长调节剂的作用原理，还缺乏深入的认识。所以本研究以核桃品种‘中宁盛’为试材，建立了多激素免疫胶体金定位技术体系，从组织、生理及分子水平上研究了核桃嫩枝插穗复幼前后不定根发生的调控机制，获得以下主要结果: 一、改进适用于核桃半木质化材料的石蜡组织切片法，改良了适合半木质化样本的石蜡连续切片免疫组织化学定位体系，具体改进是:用多聚甲醛和戊二醛固定剂对核桃嫩枝半木质化材料进行固定;采用40℃烤片方法可保持既不脱片并保存抗原活性;适宜的免疫组化反应抗体稀释倍数分别是，吲哚乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)是一抗50×和二抗50×，赤霉素(GA3)和玉米素核苷(ZR)是一抗100×和二抗50×;最佳银扩增显影条件为26℃下15～20min。 二、经组织学观察发现核桃复幼插穗的不定根原基发生于髓射线正对的形成层和韧皮部的交叉区域。在已有高生根率、长势一致的核桃嫩枝扦插体系的基础上，即扦插20d后核桃品种‘中宁盛’的复幼插穗生根率达到98.1％，而未经复幼处理（成龄）的插穗没有不定根发生。复幼插穗扦插3d时形成层细胞开始旺盛分裂，第4d形成层明显增厚，随后产生根分生组织，7d时可观察到细胞分裂引起的根原始细胞发生，9d时根原基形成并向外生长，15d时不定根发育完全。 三、复幼处理改变了核桃插穗的内源激素水平。采用连续组织切片通过免疫组织化学测定，结合对复幼扦插过程多种内源激素的高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS)测定，同步研究了不定根发生过程中内源IAA、ABA、GA3、ZR和玉米素(ZT)的时空分布及动态变化。发现不定根诱导初期，多种植物激素主要分布于成熟插穗和复幼插穗基部的韧皮部筛管和伴胞中。并且，复幼插穗中IAA水平高于成熟捅穗，而ABA、GA3和ZR水平则是成熟插穗中高。 四、发现复幼插穗在生根诱导过程中的多激素时空分布特征。发现GA3早于IAA、ABA和ZR分布在韧皮部筛管和其伴胞以外的细胞中，随后在形成层和韧皮部的交叉区域中观察到IAA积累，并且根原基发生于此。但是，在成熟插穗中四种植物激素一直只分布于筛管和伴胞中。筛管及其伴胞中植物激素水平的改变，植物激素活性的提高，尤其是形成层和韧皮部交叉部分IAA水平的提高可以解释复幼处理提高不定根发生能力的原因。根据研究结果提出核桃复幼插穗的植物激素时空变化模型。 五、外源IBA诱导调控插穗内源激素改变是促进不定根发生的另一重要因素。外源生长素诱导处理对核桃插穗生根率有显著影响，IBA诱导处理的插穗在扦插过程中内源激素变化明显，IAA和GA3逐渐升高，于5d时根分生组织形成时达到峰值后降低;ABA先降低至7d时短暂回升后再下降;ZT于5d时后才开始升高。 六、采用核桃插穗扦插不同天数的RNA-seq数据和激素含量变化进行关联分析，发现PIN6、ABP19、SAUR21、GA2ox和GA20ox2等5个基因与激素含量变化相关，GO和KEGG分析表明这些基因主要参与生长素运输（PIN6）、响应外源生长调节剂诱导响应（SAUR21）、生长素信号转导受体(ABP19)和赤霉素合成（GA2ox和GA20ox2）。 本研究在组织化学、生理生化及分子水平上阐释核桃复幼处理促进根原基发生的内源激素互作机制方面有创新。

目录

声明

摘要

第一章绪论

1．1．1研究背景

1．1．2研究目的和意义

1．1．3项目来源与经费支持

1．2国内外研究现状及评述

1．2．1木本植物无性繁殖

1．2．2木本植物不定根发生机制的研究

1．2．3激素在木本植物不定根发生中的作用

1．2．4植物激素的研究方法

1．2．5核桃属植物不定根发生及其相关机理研究进展

1．3研究目标和主要研究内容

1．3．1关键的科学问题与研究目标

1．3．2主要研究内容

1．4技术路线

第二章核桃扦插生根的免疫组织化学定位体系

2．1材料与方法

2．1．1试验材料培养

2．1．2免疫组织化学染色

2．2结果与分析

2．2．1核桃插穗生根率

2．2．2不同固定剂处理的石蜡组织切片比较

2．2．3核桃插穗的激素免疫胶体金体系建立

2．2．4免疫胶体金可靠性验证

2．3小结与讨论

第三章复幼促进核桃扦插生根的组织形态研究

3．1材料与方法

3．1．1试验材料

3．1．2试验方法

3．2结果与分析

3．2．1扦插过程各插穗的外部形态特征

3．2．2扦插过程插穗基部组织结构的变化

3．2．3插穗基部各组织比例变化

3．3小结与讨论

3．3．1复幼对插穗形态及组织结构的影响

3．3．2复幼插穗扦插不定根的发生

第四章复幼对核桃插穗多激素分布及水平的影响

4．1材料与方法

4．1．1试验材料

4．1．2试验方法

4．2结果与分析

4．2．1扦插处理前插穗基部各激素的原位分布

4．2．2扦插前插穗基部四种激素的免疫半定量分析

4．2．3核桃插穗基部四种激素的定量分析

4．3小结与讨论

第五章复幼促进核桃生根的多激素时空变化研究

5．1材料与方法

5．1．1试验材料

5．1．2试验方法

5．2结果与分析

5．2．1 IAA在不定根发生过程的原位分布

5．2．2 ABA在插穗基部的时空分布

5．2．3 GA3在插穗基部的时空分布

5．2．4 ZR在插穗基部的时空分布

5．2．5四种激素的免疫半定量分析

5．2．6不定根诱导过程四种植物激素的分布模型

5．3小结与讨论

5．3．1生长素在生根中的作用

5．3．2生长素与赤霉素在生根中的互作

5．3．3赤霉素、脱落酸和细胞分裂素在生根中的作用

第六章IBA诱导对复幼核桃扦插生根及多激素时空分布的影响

6．1材料与方法

6．1．1试验材料

6．1．2试验方法

6．2结果与分析

6．2．1施加IBA对核桃复幼插穗生根效果的影响

6．2．2复幼插穗扦插过程内源激素的时空分布

6．2．3插条生根过程内源激素的动态变化

6．3小结与讨论

6．3．1IBA诱导对插穗内源激素分布的影响

6．3．2 IBA诱导对插穗内源激素水平的影响

第七章核桃生根过程中激素相关基因表达及关联分析

7．1材料与方法

7．1．1试验材料

7．1．2插穗内源激素含量测定

7．1．3激素水平及相关基因表达水平的关联分析

7．1．4实时荧光定量PCR验证

7．2结果及分析

7．2．1嫩枝插穗扦插前期内源激素含量变化

7．2．2基因关联分析

7．2．3基因表达量qRT-PCR验证

7．3小结与讨论

第八章结论与展望

8．1结论

8．2创新点

8．3展望

第九章(附件)凉山州核桃坚果表型多样性研究

9．1材料与方法

9．1．1试材采集地概况

9．1．2试材采集与处理

9．1．3试验方法

9．1．4数据分析

9．2结果与分析

9．2．1坚果表型质量性状的频率分布及多样性指数

9．2．2坚果表型数量性状的范围及频率

9．2．3坚果表型的变异和分化

9．2．4居群间表型综合性状的聚类分析

9．3小结和讨论

9．4结论

参考文献

附录

在读期间的学术研究

致谢