沿海防护林树种促生、耐盐根系真菌筛选及机制初探

摘要

土壤盐渍化是制约沿海防护林建设的重要因素之一。提高林木生产力和适逆性（特别是耐盐能力）是进一步发挥林业生态和经济效益的重要举措。利用传统育种、细胞工程和基因工程技术提高植株耐盐碱能力已取得一系列重要进展，然而，林木耐盐性是由多个数量性状基因控制的复杂性状，且育种周期长。因此在林木耐盐常规和分子育种研究中仍遇到了很大挑战。根际共生菌对提高农林植物生产力和适应性至关重要。根系非菌根真菌（non-mycorrhizal fungi，包括根际真菌和内生真菌）就是一类普遍存在的能够对植物表型和生理产生重要调控作用的微生物。但是，目前对非菌根真菌（特别在极端环境中）协同林木生长及耐盐的潜力与机制的认识还十分有限。本论文在构建丰富的林木非菌根真菌资源库基础上，以杨树和枫香等重要沿海防护林树种为研究对象，旨在研究非菌根真菌对苗木生长和耐性能力的调控效应并初步阐明可能的作用机制，最后对林木根部菌剂接种方法进行优化。研究结果为创制新型植物促生、抗逆型接种剂奠定理论基础，为今后成果转化和应用提供新的技术依据。
　　本研究对浙江富阳、江苏泗洪和河北威县良种基地的杨树以及多种滩涂盐生植物的根系非菌根真菌进行分离培养。同时，依托于国内外合作基础，搜集了多种根系内生真菌资源。因此初步构建了多生境、多宿主来源的根系非菌根真菌资源库。以重要沿海防护林树种毛白杨（Popults tomentosa）和美洲黑杨杂种优良无性系NL-895杨（P.×euramericana cv.‘Nanlin895’，NL895）无性系无菌苗及北美枫香（Liquidambar styraciflua)的实生苗为研究对象，将供试菌株接种到上述苗木根系中，通过添加海盐溶液筛选具有促生和耐盐效应的菌株。主要研究结果如下:
　　(1)供试菌株基础生物学特性及功能初筛:选用45株真菌菌株，包括33株子囊菌(Ascomycota)，4株担子菌(Basidiomycota)与8株低等菌。主要类群有镰刀菌属（Fusarium）、格孢腔目(Pleosporales)、柔膜菌目(Helotiales)和被孢霉属(Mortierella)等真菌。建立上述菌株与毛白杨和NL-895杨无性系无菌苗的共生体系，通过观察杨树幼苗接种后的表型变化（主要包括株高、根长和鲜重等指标）及根部细胞是否有侵染结构形成，初步筛选具有潜在促生效应的功能菌株。
　　(2)内生弯孢霉菌株对毛白杨的促生、耐盐效应:源自盐生植物盐地碱蓬(Suaeda salsa)健康植株根系的内生弯孢霉（Curvularia sp.）菌株R2015-25可与毛白杨（P.tomentosa）顺利建立共生体系并表现出显著的促生效应。显微观察表明接种14d后，R2015-25的菌丝可顺利侵染定殖在毛白杨的根部并形成类似微菌核的侵染结构，在皮层细胞和根毛中可见念珠状菌丝。说明该菌株可能属于暗色有隔内生真菌（dark septate endophyte，DSE）。盆栽试验中，施加海盐胁迫后，处理组杨树的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)显著高于对照组;叶绿素a、叶绿素b和脯氨酸(proline，Pro)含量也有所上升。处理组杨树叶片光反应系统Ⅱ(photosystemⅡ，PSⅡ)的电子传递效率（electron transport rate，ETR）、PSⅡ实际光合效率ΦPSⅡ及光化学淬灭值qP均显著高于对照组。实验结果表明，菌株R2015-25接种到毛白杨上可缓解宿主杨树所受的盐胁迫，这为极端环境内生真菌资源提高林木耐盐能力的应用提供了科学依据。
　　(3)3株内生镰刀菌对北美枫香的促生、耐盐效应:探讨3株源于滩涂盐碱地植物滨麦(Leymus mollis)的内生镰刀菌（Fusarium spp.）对北美枫香幼苗生长和耐盐性的调控效应。结合形态学和分子系统学方法鉴定内生镰刀菌并体外检测其毒素种类及含量。建立内生镰刀菌与无菌北美枫香实生幼苗共培养体系;利用台盼蓝染色观察菌株在根系组织中形成的侵染结构;在正常和盐胁迫条件下，研究内生镰刀菌对幼苗生长和耐盐性的影响。3个菌株分别为黄色镰刀菌（F.culmorum，Class2-1B）、假禾谷镰刀菌(F.pseudograminearum，Class2-1C)和一株未鉴定到种的镰刀菌（Fusarium sp.，Class2-3）。Class2-1B和Class2-1C对北美枫香幼苗具有促生和协助耐盐的作用，而Class2-3显现出致病性。
　　(4)内生镰刀菌重测序与碳代谢分析:以同种或相近种镰刀菌的全基因组序列为参考，对3株盐生植物内生镰刀菌（Class2-1B、Class2-1C和SYC-Root-1）进行全基因组重测序分析，并对重测序数据进行初步统计分析。采用BIOLOG真菌板比较分析3株内生镰刀菌的碳代谢活性，以期进一步揭示3株镰刀菌的生理生态学特性。
　　(5)内生镰刀菌及弯孢霉GFP转化体系构建:为深入研究三株功能菌株弯孢霉(Curvulariasp.)、黄色镰刀菌(F.culmorum)和假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum）在林木根系的侵染定殖特征以及跟踪菌株在大田实验中的实际侵染效率，利用根癌农杆菌介导转化法（Agrobacterium tumefaciens mediated transformation，ATMT）获得绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein，GFP)标记的三株菌株。将获得的标记菌株接种至杨树幼苗根系共培养14d以上。荧光显微观察表明，三株功能菌株的菌丝可在杨树幼苗根系成功侵染定殖。该研究体系为后期有效跟踪检测功能菌株的生态学特征奠定了技术基础。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1．1 研究背景

1．1．2 国内外研究现状及评述

1．2 研究目标和主要研究内容

1．2．1 关键的科学问题与研究目标

1．2．2 主要研究内容

1．3 研究技术路线

第二章 供试菌株基础生物学特性与初步筛选

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 结果与分析

2．2．1 供试菌株的形态特征与产孢情况

2．2．2 供试菌株菌种鉴定与系统发育分析

2．2．3 共生真菌菌株对杨树幼苗生长的影响

2．2．4 部分菌株在杨树幼苗形成的侵染特征

2．3 小结

第三章 内生弯孢霉菌株对毛白杨的促生、耐盐功能

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 弯孢霉侵染杨树根系结构

3．2．2 弯孢霉对毛白杨生长的促进效应

3．2．3 供试杨树酶活与脯氨酸水平变化

3．2．4 接种弯孢霉对杨树叶绿体色素含量和叶绿素荧光的影响

3．3 小结

第四章 3株内生镰刀菌对北美枫香的促生、耐盐效应

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果与分析

4．2．1 内生镰刀菌菌株形态学鉴定及系统发育分析

4．2．2 内生镰刀菌菌株毒素检测及含量分析

4．2．3 内生镰刀菌菌株侵染北美枫香幼苗根系特征

4．2．4 3株内生镰刀菌对北美枫香幼苗生长和耐盐性的影响

4．3 小结

第五章 内生镰刀菌全基因组重测序与碳代谢分析

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 方法

5．2 结果与分析

5．2．1 数据过滤统计结果统计

5．2．2 Reads与参考基因组的比对分析结果统计

5．2．3 SNP分析结果统计

5．2．4 Indel分析结果统计

5．2．5 SNP_InDel变异富集分析结果统计

5．2．6 SV检测及注释结果统计

5．2．7 碳代谢分析结果

5．3 小结

第六章 内生镰刀菌及弯孢霉GFP转化体系构建

6．1 材料与方法

6．1．1 材料

6．1．2 方法

6．2 结果与分析

6．2．1 3株菌株潮霉素耐受实验结果

6．2．2 3株菌株的转化子筛选结果及绿色荧光观察

6．2．3 3株菌株在杨树幼苗根系定殖特征

6．3 小结

第七章 结论与展望

7．1 结论

7．1．1 筛选重要沿海防护林树种促生、耐盐功能菌株

7．1．2 初探功能菌株促生、协助宿主耐盐机制

7．2 讨论

7．3 展望

附录

参考文献

在读期间的学术研究

致谢