Icotinib耐药NSCLC细胞株的建立及其耐药机制研究

摘要

目的:
　　近年来，随着肿瘤个体化靶向治疗的迅速发展，以吉非替尼(Gefitinib)和厄洛替尼(Erlotinib)为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermalgrowth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）在EGFR阳性突变的晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者中疗效显著。但随着用药时间的延长（12-14个月），患者最终对其产生耐药性，病情复发或进展。研究发现，EGFR-TKI潜在的耐药机制是复杂和多样的，涉及靶蛋白的改变或EGFR的T790M继发突变、EGFR下游通路中PI3K、KRAS、BRAF等基因突变、c-Met扩增或HGF过表达、发生上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和向小细胞类型转化(small cell lung cancer，SCLC)等，但是还有20-30％的耐药机制不明确，可能与表观遗传学、代谢异常等有关。肿瘤的发生和进展都会产生大量的代谢物变化，所以肿瘤也是一种代谢性疾病。利用代谢组学的方法寻找亲本细胞和耐药细胞之间差异的代谢物，有助于了解耐药发生的机制，寻找新的潜在药物靶点。
　　方法:
　　本研究中我们选用三种不同的NSCLC细胞株A549（EGFR野生型）、PC-9（EGFR敏感突变型）和H1975（EGFR T790M继发突变型），DNA直接测序法检测A549、PC-9和H1975的EGFR突变状态;采用国产的EGFR-TKI(埃克替尼，icotinib)在体外以小剂量浓度梯度递增法诱导建立埃克替尼耐药株A549/IR、PC-9/IR和H1975/IR。从不同角度对耐药株进行鉴定:3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐法(3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT)检测PC-9/IR的耐药性及耐药稳定性;光镜下观察其形态学变化;DNA测序法检测EGFR的T790M状态;应用Real-time PCR和Western blot检测EGFR及其旁路信号相关分子的表达;小鼠移植瘤模型检测PC-9/IR耐药细胞在体内的增殖能力。分别收集亲本细胞和耐药细胞利用核磁共振分析技术手段分析亲本细胞和耐药细胞的差异代谢物，通过主成分分析(principal component analysis，PCA)和偏最小二乘法-判别分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)分析得出载荷图和VIP(variable importance in projection，VIP)图，找到区分亲本细胞和耐药细胞贡献最大的代谢物。通过对差异代谢物代谢通路的分析推测可能的药物作用靶点，并检测针对此靶点的抑制剂对PC-9/IR耐药细胞生长和增殖的影响，以及与此靶点相关的蛋白质在PC-9/IR耐药细胞中的表达情况。
　　结果:
　　历时近8个月获得埃克替尼耐药株A549/IR(A549/Icotinib resistant)和H1975/IR，近6个月获得PC-9/IR耐药细胞。MTT法检测到A549/IR、H1975/IR和PC-9/IR对埃克替尼耐药，且PC-9/IR耐药细胞的半数抑制浓度(50％ inhibitingconcentration，IC50)是21.49μmol/L，高于PC-9亲本细胞的IC50值1.32μmol/L，达到高度耐药状态;A549/IR耐药细胞的IC50为173.73μmol/L，高于A549亲本细胞的IC50值17.46μmol/L; H1975/IR耐药细胞的IC50为196.73μmol/L，高于H1975亲本细胞的IC50值23.93μmol/L。
　　对PC-9/IR耐药的稳定性检测发现在2μmol/L埃克替尼中持续培养PC-9/IR4个月，其耐药性依然稳定;PC-9/IR耐药细胞未发生T790M继发突变。PC-9/IR耐药细胞中EGFR、PI3K、AKT、STAT3和c-Met的表达水平较亲本株高，分别为12.09、5.73、3.72、7.44和5.31倍;埃克替尼不能抑制PC-9/IR耐药细胞中AKT和STAT3的活化且多药耐药蛋白ABCG2(ATP-binding cassette superfamily Gmember2，ABCG2)在PC-9/IR耐药细胞中表达量升高;结合c-Met及下游分子在PC-9/IR耐药细胞中表达升高且利用c-Met抑制剂（克唑替尼，crizotinib）可以抑制PC-9/IR耐药细胞体外、体内的增殖，提示PC-9/IR耐药细胞发生了c-Met旁路活化。
　　核磁共振分析技术得到A549/IR、H1975/IR、PC-9/IR和A549、PC-9、H1975的代谢指纹图谱，分析6大类包括氨基酸及衍生物、有机酸类、糖类、醇类、核苷酸组分等共62种代谢物的浓度。运用PCA主成分分析和PLS-DA多元统计分析得到亲本细胞和耐药细胞代谢轮廓相异，并分别得出VIP值大于1的15种区分亲本细胞和耐药细胞代谢差异的代谢物。三种不同EGFR状态的细胞系，筛选得到的区分亲本细胞和耐药细胞的差异代谢物不完全相同:区分PC-9细胞和PC-9/IR耐药细胞的标志差异代谢物是谷氨酸，醋酸盐、尿酸、胆碱和丙氨酸;区分A549和A549/IR细胞的差异代谢物是谷氨酸、谷氨酰胺、乳酸、天冬氨酸和谷胱甘肽;区分H1975细胞和H1975/IR耐药细胞的差异代谢物是乳酸、谷氨酸、牛磺酸、醋酸盐和脯氨酸。
　　PC-9/IR耐药细胞的生长对谷氨酰胺存在浓度依赖性，促进谷氨酰胺酶表达的c-Myc基因在PC-9/IR耐药细胞中表达升高且埃克替尼不能抑制c-Myc在PC-9/IR耐药细胞中表达。谷氨酰胺酶抑制剂Compound968可以抑制PC-9/IR耐药细胞在体外的增殖。
　　结论:
　　成功建立了A549/IR、H1975/IR和PC-9/IR三株耐药细胞。研究结果提示PC-9/IR的耐药与c-Met活化、ABCG2表达升高及代谢变化有关。谷氨酰胺代谢通路是潜在的药物靶点，初步的研究结果提示谷氨酰胺酶抑制剂可以抑制PC-9/IR的增殖且存在剂量依赖性。

目录

声明

致谢

摘要

1 背景介绍

1．1 前言

1．2 EGFR的结构和功能

1．3 EGFR突变状态和EGFR-TKI的作用机制

1．4 EGFR-TKI的耐药机制

1．4．1 原发性耐药机制

1．4．2 获得性耐药机制

1．5 肿瘤与代谢

1．5．1 “Warburg效应”学说

1．5．2 肿瘤细胞代谢特点—有氧糖酵解

1．5．3 肿瘤细胞代谢另一特点——消耗大量谷氨酰胺

1．5．4 抑制能量代谢杀灭肿瘤细胞

1．6 代谢组学及其应用

1．7 本研究目的和意义

2 实验材料

2．1 细胞系

2．2 实验动物

2．3 药品

2．4 主要试剂

2．5 主要仪器设备

2．6 主要缓冲液配制

3 实验方法

3．1 细胞培养

3．2 EGFR突变状态的检测

3．2．1 细胞中基因组DNA提取

3．2．2 DNA定量

3．2．3 PCR扩增

3．2．4 琼脂糖凝胶电泳检测

3．2．5 测序

3．3 耐药细胞株的建立

3．3．1 MTT法检测埃克替尼对细胞活性的影响

3．3．2 埃克替尼对细胞克隆形成能力的检测

3．3．3 检测埃克替尼对细胞凋亡的影响

3．3．4 耐药细胞株的诱导

3．4 耐药细胞株的鉴定

3．4．1 耐药细胞株耐药指数的测定

3．4．2 耐药稳定性的检测

3．4．3 耐药细胞株形态学的观察

3．4．4 EGFR T790M突变状态检测

3．4．5 Real-time PCR检测EGFR及其旁路信号相关分子表达

3．4．6 Western blot检测EGFR及其旁路信号相关分子磷酸化及总蛋白表达

3．4．7 PC-9／IR耐药细胞株皮下移植瘤模型的建立

3．5 不同细胞株代谢差异物的分析

3．5．1 样本收集

3．5．2 样本制备

3．5．3 采集核磁数据参数

3．5．4 核磁数据处理

3．6 谷氨酰胺酶抑制剂对PC-9／IR耐药细胞的影响

3．6．1 谷氨酰胺对PC-9／IR耐药细胞的影响

3．6．2 Western Blot检测PC-9／IR耐药细胞中谷氨酰胺相关蛋白表达

3．6．3 Compound 968对PC-9／IR耐药细胞的影响

3．7 统计学处理

4 实验结果

4．1 A549、H1975和PC-9细胞EGFR突变状态的检测

4．1．1 EGFR18、19、20、21外显子PCR扩增

4．1．2 直接测序法-检测EGFR基因突变的结果

4．2 耐药细胞株的建立

4．2．1 埃克替尼对不同EGFR突变状态细胞生长的影响

4．2．2 埃克替尼对PC-9细胞克隆能力形成的影响

4．2．3 埃克替尼对PC-9细胞凋亡的影响

4．3 耐药细胞株的鉴定

4．3．1 MTT法测耐药细胞的耐药性

4．3．2 耐药细胞株稳定性的测定

4．3．3 耐药细胞的形态学观察

4．3．4 EGFR T790M突变检测

4．3．5 c-Met过表达的检测

4．3．6 PC-9／IR耐药株小鼠移植瘤模型的建立及其体外、内增殖能力的检测

4．4 NMR检测亲本细胞和耐药细胞代谢物差异

4．4．1 代谢轮廓归属谱图

4．4．2 代谢物种类与浓度

4．4．3 多变量统计学分析

4．5 PC-9／IR耐药细胞生长对谷氨酰胺存在依赖性

4．5．1 谷氨酰胺酶抑制剂抑制PC-9／IR耐药细胞的增殖

4．5．2 c-Myc在PC-9／IR耐药细胞中的表达情况

5 讨论

6 结论

参考文献

附录

作者简历及攻读硕士学位期间取得的研究成果

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