毕赤酵母重组人hepcidin25的高效表达、纯化及部分铁代谢活性研究

摘要

Hepcidin是一种由肝脏表达的富含半胱氨酸残基的小分子肽，对于调节机体铁离子代谢平衡发挥着重要作用。与许多富含半胱氨酸的抗菌肽类似，hepcidin同样具有广谱的抗菌作用。本文对构建的分泌表达人hepcidin巴斯德毕赤酵母重组pPICZα A-Hepc菌株的高表达发酵条件进行优化，研究了重组人-hepcidin的纯化工艺，通过抑菌及小鼠内皮细胞的转染实验证实酵母表达重组人-hepcidin25具有抗微生物活性及调节细胞内铁代谢活性。 巴斯德毕赤酵母作为外源蛋白表达系统有很多优点，但也有其不足之处，比如产量普遍较低。提高产量，除了可选用强启动子，使用酵母偏爱的密码子及外源基因高拷贝整合等方法，在发酵过程中控制生物反应状态，使细胞生长至高的密度并使细胞生理状态维持高的活力，以获得尽可能多的产品也至关重要。针对这一问题，本文优化巴斯德毕赤酵母发酵培养基的组成以及培养条件，考察了不同培养基C源N源对细胞生长及外源基因表达的影响。在摇瓶中，对发酵条件进行了研究．发现较适合的培养条件为：基础发酵培养基以葡萄糖20g/L为碳源，蛋白胨20g/L，0．1mol/L磷酸钾缓冲，起始pH6．0，250 ml摇瓶装液量25ml，生物素4×10-4g/L，YNB13．4g/L（同比总体积量分批加入诱导培养基），甲醇诱导浓度0．5%，发酵3d后，目的蛋白产量可达150mg/L。 对重组毕赤酵母（Pichia pastoris）分泌至胞外存在于发酵液的hepcidin进一步分离纯化，选用等电沉淀，硫酸铵分级沉淀，阴离子交换层析，阳离子交换层析，凝胶过滤纯化，反相色谱纯化等步骤，确定纯化工艺为等电沉淀，凝胶分子筛层析，反相色谱精纯，得到的目的蛋白电泳检测样品呈现单一条带，纯度不低于90%。质谱分析重组hepcidn分子量与计算一致，CD光谱证实重组hepcidin结构与天然类似。 通过抑菌实验、转染小鼠内皮细胞w estern blot检测胞内GFP-FPN1及TfR1的变化测定重组hepcidin的生理活性。研究发现重组hepcidin具有抗菌活性，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌抗菌效果明显，对大肠杆菌无明显作用效果。转染内皮细胞证实重组hepcidin可影响内皮细胞GFP-FPN1及TfR1的表达；通过流式细胞仪检测了重组hepcidin-25处理不同时间后细胞LIP的变化。实验证实酵母表达的重组hepcidin具有调节铁代谢活性，对研究hepcidin与铁代谢的相关分子吸收机制及药物开发应用奠定了基础，对潜在的医学诊断治疗具有重要意义。

目录

文摘

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声明

第一章绪论

1.1 hepcidin的分子结构

1.2 hepcidin与铁稳态

1.2.1铁的生理作用及吸收过程

1.2.2人体内铁代谢调节

1.2.3 hepcidin与铁代谢

1.2.4 hepcidin调节铁代谢的机理

1.2.5 hepcidin的其他功能

1.3 hepcidin的表达调控

1.3.1机体铁负荷增多诱导hepcidin mRNA表达

1.3.2机体缺铁可显著下调hepcidin mRNA的表达

1.3.3贫血和缺氧可显著降低hepcidin mRNA的表达

1.3.4细菌、致炎物质和细胞因子

1.3.5 C／EBPa是调节肝细胞hepcidin表达的重要激活分子

1.3.6 Hepcidin的应用前景与制备方法

1.4毕赤酵母表达系统提高表达量的几个关键点

1.4.1启动子的研究

1.4.2外源基因高拷贝整合

1.4.3基因序列的密码子偏爱

1.4.4宿主菌的选择

1.4.5高密度发酵

1.5蛋白纯化的方法选择

1.5.1蛋白沉淀

1.5.2离子交换色谱

1.5.3排阻层析

1.5.4疏水作用层析

1.5.5亲和层析

1.5.6电泳

1.6论文的研究思路

第二章 hepcidin高产条件优化

2.1实验材料

2.1.1菌株

2.1.2培养基及试剂

2.1.3仪器设备

2.2实验方法

2.2.1诱导表达

2.2.2蛋白浓度的测定

2.2.3 Tricine-SDS-PAGE电泳

2.2.4高产条件的优化

2.2.5细胞干重的测定

2.3结果与分析

2.3.1蛋白浓度的测定

2.3.2碳源对发酵的影响

2.3.3氮源对发酵的影响

2.3.4不同pH的影响

2.3.5不同溶氧的影响

2.3.6不同甲醇诱导浓度对蛋白产量的影响

2.3.7无氨基酵母氮源YNB添加方式对蛋白产量的影响

2.3.8 Tricine-SDS-PAGE电泳

2.4本章小结

第三章纯化条件的研究

3.1实验材料

3.1.1试剂

3.1.2仪器

3.2实验方法

3.2.1沉淀法

3.2.2阳离子交换层析法纯化

3.2.3阴离子交换色谱法纯化目的蛋白

3.2.4凝胶层析

3.2.5反相色谱纯化

3.2.6纯化产物的处理

3.3结果与讨论

3.3.1沉淀法

3.3.2阳离子交换层析

3.3.3阴离子交换层析

3.3.4 Sephadex G-25凝胶层析

3.3.5反相色谱纯化

3.3.6圆二色光谱

3.3.7质谱分析

3.4本章小结

第四章重组hepcidin生物活性分析

4.1实验材料

4.1.1试剂

4.1.2 仪器

4.2实验方法

4.2.1抗微生物活性分析

4.2.2调节铁代谢活性分析

4.3实验结果与分析

4.3.1抗菌活性

4.3.2 酵母表达人hepcidin-25对FH4细胞蛋白表达变化的影响

4.3.3酵母表达hepcidin-25对FH4细胞LIP的影响

4.4本章小结

第五章结论

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

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