外源β-胡萝卜素基因表达对酿酒酵母甲羟戊酸途径中关键酶的影响

摘要

β-胡萝卜素(β-Carotene)是类胡萝卜素家族中的典型代表，具有较强的抗氧化活性和清除自由基的能力，作为食品添加剂、营养增补剂和医药制剂等，具有广泛的应用。甲羟戊酸是甲羟戊酸途径生成异戊二烯焦磷酸(IPP)的中间代谢物质，也是萜烯类物质合成的重要中间体，通过高度精细的机制调节甲羟戊酸和类异戊二烯的合成和分配，这对维持酵母细胞正常的生长和生理代谢至关重要，由于β-胡萝卜素的合成需要甲羟戊酸途径多数中间体，所以外源β-胡萝卜素基因在酿酒酵母中的引入及表达对酿酒酵母内源甲羟戊酸途径产生影响.本文讨论了外源β-胡萝卜素基因表达对酿酒酵母甲羟戊酸途径中关键酶的影响。
　　 (1)较高的发酵温度(30℃)有利于细胞的生长，但较低的温度(25℃)却能够获得较高的比产物合成速率，因此采用两阶段温度培养控制策略:发酵前20 h内，温度控制为30℃，20 h后降低至25℃直至发酵结束。在此策略下，最高β-胡萝卜素产量和β-胡萝卜素合成速率分别达到56.42 mg/L和1.28 mg/L·h，与单一温度发酵模式的最高水平(30℃)相比分别提高了25.7％和14.3％。
　　 (2)在7L发酵罐培养时，采用两阶段pH控制策略，发酵前24h，pH控制为7，24 h后降低至5，直至发酵结束，单位细胞的β-胡萝卜含量、合成速率分别为50.37 mg L和1.40mg/L·h，与单一pH为7发酵模式下相比，分别提高了19.0％、18.6％。并且较低pH能诱导氧化压力的产生，导致色素的大量合成。
　　 (3)构建空质粒Y(l)plac211，整合到酿酒酵母FY1679-01B的基因组，作为对照菌株，使其与有目的基因的菌株具有相同的遗传背景。通过对含有β-胡萝卜素基因的酿酒酵母甲羟戊酸途径中关键酶的分析发现:发现产色素含量高01BS菌株生长慢、麦角固醇合成量低、β-胡萝卜素和番茄红素合成量高;在发酵后期18h葡萄糖消耗速率快，26h乙酸下降快;HMG1、HMG2、ERG20表达量高，ERG9、RER2、SRT1表达量低。色素含量低的01BQ菌株这些物质含量是居于中间，而对照菌株次之。

目录

声明

学位论文数据集

摘要

第一章 引言

1．1 β-胡萝卜素的结构与性质

1．2 β-胡萝卜素的代谢、生理功能

1．3 β-胡萝卜素的应用及发展前景

1．4 β-胡萝卜素在S．cerevisiae中合成途径

1．4．1 中间体IPP的合成途径

1．4．2 中间体GGPP的合成途径

1．4．3 GGPP合成β-胡萝卜素途径

1．5 β-胡萝卜素生产与合成调控

1．5．1 天然物萃取法

1．5．2 化学合成法

1．5．3 野生菌株微生物发酵法

1．5．4 微生物合成β-胡萝卜素调控

1．6 基因工程法生产β-胡萝卜素研究进展

1．6．1 微生物基因工程法合成β-胡萝卜素

1．6．2 植物基因工程法合成β-胡萝卜素

1．7 外源基因表达对酿酒酵母甲羟戊酸途径的影响

1．8 论文的选题意义和主要研究内容

1．8．1 论文的选题意义

1．8．2 主要研究内容

1．8．3 研究方案

第二章 温度及pH对重组葡萄酒酵母合成β-胡萝卜素的影响

2．1 实验材料及仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器

2．2 实验菌种与培养基

2．3 实验方法

2．3．1 菌种培养

2．3．2 细胞生物量和还原糖测定

2．3．3 β-胡萝卜素提取及含量测定

2．3．4 过氧化氢酶活性测定

2．3．5 超氧化物歧化酶(SOD)酶活性测定

2．3．6 细胞中总蛋白测定

2．3．7 动力学参数计算

2．4 标准曲线

2．4．1 β-胡萝卜素标准曲线

2．4．2 细胞干重标准曲线

2．4．3 蛋白含量标准曲线

2．5 结果与讨论

2．5．1 温度对重组葡萄酒酵母合成β-胡萝卜素的影响

2．5．2 pH对重组葡萄酒酵母合成β-胡萝卜素的影响

2．6 结论

第三章 外源β-胡萝卜素基因表达对酿酒酵母甲羟戊酸途径中关键酶的影响

3．1 实验材料及仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验仪器

3．2 实验菌种与培养基

3．3 实验方法

3．3．1 质粒提取

3．3．2 目的片断凝胶回收

3．3．3 转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞

3．3．4 酵母感受态的制备

3．3．5 共转化

3．3．6 酵母基因组DNA的提取

3．3．7 细胞生物量测定

3．3．8 发酵液中乙醇、乙酸、甘油、葡糖糖测定

3．3．9 β-胡萝卜素、番茄红素及总色素提取及含量测定

3．3．10 麦角固醇提取测定

3．3．11 RNA提取

3．3．12 琼脂糖凝胶电泳检测所提取RNA的质量

3．3．13 cDNA的合成

3．3．14 用于Real Time PCR的引物设计

3．3．15 Real Time PCR检测基因表达

3．4 标准曲线

3．5 结果与讨论

3．5．1 空质粒构建

3．5．2 β-胡萝卜素基因表达对酿酒酵母甲羟戊酸途径影响

3．6 结论

第四章 全文总结及展望

4．1 结论

4．2 展望

参考文献

致谢

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