酿酒酵母不同生长周期细胞对乙醇胁迫的响应

摘要

对化石能源的过度依赖易造成能源危机，且会导致环境污染加剧，这使得人们迫切需要寻找可再生的清洁能源以替代传统化石能源。燃料乙醇作为新兴能源的代表已经成为世界各国研究和发展的热点。目前工业生产燃料乙醇利用酿酒酵母进行生物发酵，但在利用此法生产燃料乙醇常常遇到乙醇胁迫、染菌等问题，这些问题会导致乙醇产量下降，降低生物乙醇的市场竞争力。随着发酵过程的进行，逐渐积累的乙醇会抑制酿酒酵母的生长和其他正常的必要生理活动，最终导致乙醇终产量和生产效率降低。纵观整个发酵过程，酿酒酵母细胞自身的生长和乙醇的生产既相互独立，又不可分割，酿酒酵母的生长必然伴随着对于外环境乙醇胁迫的适应，而实现乙醇的高效生产也离不开酿酒酵母的大量繁殖。
　　本文旨在通过研究酿酒酵母在发酵过程中如何实现对外界乙醇压力的自适应及其调节过程，对进一步获得高乙醇耐受能力的工程菌提供指导。首先，对酿酒酵母正常发酵条件下的生长曲线、细胞直径和发酵液pH值进行了测定与分析。选定以发酵2小时的酵母细胞代表延迟期细胞、发酵8小时的酵母细胞代表指数期细胞、发酵16小时的酵母细胞代表稳定期细胞。同时，比较了不同生长周期酿酒酵母细胞内海藻糖、麦角固醇和脂肪酸含量的差异，其中麦角固醇的含量随乙醇浓度的升高而增加;海藻糖和脂肪酸含量、脂肪酸的比例随着乙醇浓度升高有明显变化。此外，通过实时荧光定量PCR对海藻糖和脂肪酸代谢相关基因的表达量进行测定，结果表明海藻糖降解基因ATH1、NTH1和NTH2在指数期的表达受到抑制，海藻糖合成基因TPS1和TPS2在稳定期的表达量增加，而TPS3、TSL在稳定期的表达量降低;脂肪酸合成酶ACC1和HFA1在指数期和稳定期的表达量均比延迟期高，而脂肪酸脱氢酶OLE1在指数期的表达量显著上升而在稳定期的表达量显著下降。在此基础上，对不同生长周期酿酒酵母细胞进行代谢组学分析，从更细致的分子生物学角度了解在发酵过程中酿酒酵母是如何在对抗外环境中逐渐增强的乙醇胁迫的同时实现种群的生长和繁殖。分析代谢组学实验结果发现，不同生长周期酿酒酵母细胞代谢差异明显，指数期细胞氨基酸代谢旺盛，而稳定期细胞氨基酸代谢有所下降，但糖类代谢和有机酸代谢较强。实验结果表明，酿酒酵母细胞细胞膜在对抗乙醇胁迫时发挥了重要功能，随着乙醇胁迫的增强，细胞膜结构变得松散、流动性增强。同时，不同生长周期的酵母细胞代谢差异明显且各有其特点。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 燃料乙醇发展现状

1．2 工业生产燃料乙醇

1．2．1 燃料乙醇工业发酵生产菌

1．2．2 酿酒酵母发酵途径

1．3 酿酒酵母细胞发酵过程中的细胞周期

1．4 发酵过程中的乙醇胁迫和酿酒酵母的乙醇耐受性

1．5 乙醇胁迫下海藻糖对酿酒酵母细胞的保护

1．6 乙醇胁迫下细胞膜对酿酒酵母细胞的保护

1．6．1 脂肪酸对酿酒酵母细胞的保护

1．6．2 麦角固醇对酿酒酵母细胞的保护

1．7 酿酒酵母细胞发酵的代谢组学研究

1．8 本课题的研究意义和主要研究内容

1．8．1 本课题的研究意义

1．8．2 本课题的主要研究内容

第二章 不同生长周期酿酒酵母细胞状态的研究

2．1 引言

2．2 实验材料与设备

2．2．1 实验材料

2．2．2 培养基配制

2．2．3 主要仪器设备

2．3 实验方法

2．3．1 发酵过程中酿酒酵母生长情况的评价

2．3．2 不同生长周期酿酒酵母细胞乙醇耐受能力的评价

2．4 实验结果

2．4．1 发酵过程中酿酒酵母的生长情况

2．4．2 不同生长周期酿酒酵母细胞乙醇耐受能力

2．5 本章小结

第三章 不同生长周期酿酒酵母细胞海藻糖代谢的研究

3．1引 言

3．2 实验材料与设备

3．2．1 实验材料

3．2．2 培养基配制

3．2．3 主要仪器设备

3．3 实验方法

3．3．1 不同生长周期酿酒酵母细胞内海藻糖的测定

3．3．2 海藻糖相关基因表达量的测定

3．4 实验结果

3．4．1 不同生长周期酿酒酵母细胞内海藻糖含量的变化

3．4．2 海藻糖相关基因的表达量的变化

3．5 本章小结

第四章 不同生长周期酿酒酵母细胞细胞膜的研究

4．1 引言

4．2 实验材料与设备

4．2．1 实验材料

4．2．2 培养基配制

4．2．3 主要仪器设备

4．3 实验方法

4．3．1 不同生长周期酿酒酵母细胞膜物理性质变化的研究

4．3．2 不同生长周期酿酒酵母细胞膜化学成分变化的研究

4．3．3 不同生长周期酿酒酵母脂肪酸相关基因表达量变化的研究

4．4 实验结果

4．4．1 不同生长周期酿酒酵母细胞膜物理性质变化

4．4．2 不同生长周期酿酒酵母细胞膜化学成分的变化

4．4．3 不同生长周期酿酒酵母脂肪酸相关基因表达量变化

4．5 本章小结

第五章 不同生长周期酿酒酵母细胞的代谢组学研究

5．1 引言

5．2 实验材料与设备

5．2．1 实验材料

5．2．2 培养基配制

5．2．3 主要仪器设备

5．3 实验方法

5．4 实验结果

5．5 本章小结

第六章 实验总结与建议

6．1 主要结论

6．2 建议

参考文献

附录

致谢

作者与导师简介