利用定向进化提高来自洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)中R型ω-转氨酶的活性

摘要

ω-转氨酶是一种可以可逆催化氨基受体与氨基供体间氨基转移反应的转移酶。相对于S型ω-转氨酶，研究起步较晚的R型ω-转氨酶目前备受关注。
　　本文通过定向进化的方法，将实验室筛选得到的来自洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)中新型R型ω-转氨酶的酶活进行改造，以提高酶活。通过使用向易错PCR体系中同时加入Mg2+与Mn2+的方法，使目的片段在易错PCR过程中发生突变，产生突变文库。成功得到一株活性提高的突变体，其116位苏氨酸变为赖氨酸，408位组氨酸变为精氨酸，活性相对于Pdbc提高了1.8倍。
　　通过切除酶Pdbc N端170个氨基酸，得到了酶Pdbc JQ，其酶活为37.64U/mg，相对于Pdbc(酶活为32.40U/mg)略有提高。这给我们进行同源建模奠定了基础。
　　使用同源建模和分子动力学模拟，成功得到Pdbc JQ的分子模型。通过对底物结合口袋周围氨基酸进行定点饱和突变，我们发现，相比位于无规则卷曲和蛋白质两个二级结构连接处的氨基酸，位于β折叠上氨基酸的改变，对于酶活性的影响较小。同时，将237位、238位、239位这三个位于无规则卷曲的氨基酸进行饱和突变，得到活性提高的突变体L237Q，其酶活为149.77U/mg，比Pdbc JQ提高了3.97倍。
　　在酶动力学参数研究中发现，Pdbc JQ与Pdbc相比，无论对于底物R-苯乙胺，还是对于底物丙酮酸钠，酶的Km均减小，且催化效率增大，但并没有表现出明显优势。而突变体237Q与Pdbc JQ相比，对于底物R-苯乙胺，Km值由25.57mM变为6.63mM，Kcat由0.020min-1变为0.025min-1，催化效率提高了4.44倍;对于底物丙酮酸钠，Km值由27.22mM变为15.80mM，Kcat由0.031min-1变为0.073min-1，催化效率提高了4.05倍。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 转氨酶

1．1．1 转氨酶简介

1．1．3 转氨酶的催化机制

1．2 手性胺类药物

1．2．1 手性药物及其制备方法

1．2．2 手性胺类药物及其制备方法

1．3 ω-转氨酶研究进展

1．4．1 定向进化的意义与方法

1．4．2 定向进化的应用

1．4．3 计算机在定向进化技术中的应用

1．5 课题的研究内容、目的及意义

1．5．1 课题研究内容

1．5．2 课题研究的目的与意义

第二章 建立易错PCR突变文库

2．1 引言

2．2 实验仪器及试剂

2．3 实验过程

2．3．1 浓度测定

2．3．2 高通量筛选方法

2．3．3 易错PCR体系的建立

2．3．4 建立易错PCR突变文库

2．3．5 突变体的克隆表达

2．4 实验结果分析

2．4．1 标准曲线的绘制

2．4．2 易错PCR突变文库的筛选

2．4．3 突变体的克隆裹达

2．5 本章小结

3．1 引言

3．2 实验仪器及试剂

3．3 实验方法

3．3．1 Pdbc JQ的克隆表达

3．4 实验结果

3．4．1 Pdbc JQ的克窿表达

3．5 本章小结

第四章 计算机辅助Pdbc JQ分子模型建立

4．1 引言

4．2 实验仪器及软件

4．3 实验方法

4．3．1 同源建模

4．3．2 分子对接

4．3．3 分子动力学计算

4．4 实验结果分析

4．4．1 同源建模

4．4．2 分子对接

4．4．3 动力学分析

4．5 本章小结

第五章 Pdbc JQ的定点饱和突变

5．1 引言

5．2 实验仪器与试剂

5．3 实验方法

5．3．1 定点饱和突变

5．3．2 182K位定点突变

5．4 实验结果分析

5．4．1 定点饱和突变

5．4．2 182K定点突变

5．5 本章小结

第六章 Pdbc、PdbcJQ及突变体237Q酶学性质研究

6．1 引言

6．2 实验仪器及试剂

6．3 实验方法

6．3．1 最适温度

6．3．2 最适pH

6．3．3 温度耐受

6．3．4 金属离子对酶酶活的影响

6．3．5 酶的催化效率

6．4．实验结果分析

6．4．1 最适温度

6．4．2 最适pH

6．4．3 温度耐受

6．4．4 金属离子对酶活的影响

6．4．5 酶的催化效率

6．5 本章小结

第七章 总结

参考文献

附录

致谢

研究成果及发表学术论文

作者与导师简介