大肠杆菌生物合成L-2,3-二氨基丙酸

摘要

近年来，大肠杆菌作为一种模式生物被广泛应用于各种功能化合物的生产，氨基酸因其具有广泛的药用价值而备受关注。本文利用合成生物学手段，在大肠杆菌中引入L-2，3-二氨基丙酸外源路径，首次实现了其生物合成，具体工作如下:
　　1、设计了三条外源合成路径，将外源基因连接到pETDuet-1载体上，以BL21(DE3)为外源酶表达宿主。通过镍柱纯化得到三组外源酶，进行体外酶活测试。三组外源酶中，来源于金黄色葡萄球的SbnA，SbnB能够以谷氨酸和磷酸丝氨酸为底物，将其转化为目的产物L-DAP，另外两组酶并无活性。
　　2、将外源基因sbnA，sbnB转入野生型BW25113成功实现的L-DAP的生物合成。通过内源基因的过表达以及支路基因的敲除，进一步提高了目标产物的产量，L-DAP由最初的174.6mg·L-1提高到378.4mg·L-1。测试了BL21(DE3)菌株的发酵能力，并进行菌株优化，最终确定BW25113作为宿主菌。
　　3、将代谢路径分为外源基因与内源基因两个模块，通过调控内源基因与外源基因的表达强弱来进行优化，最终确定外源基因构建在高拷贝的pZE12-luc载体上，内源基因连接在中拷贝的pCS27质粒上为最优组合。
　　4、探究了不同酵母粉浓度下L-DAP对细胞生长的抑制作用，发现添加足量的酵母粉大肠杆菌能够恢复正常生长，说明L-DAP抑制了某些氨基酸的合成，酵母粉的加入弥补了氨基酸合成的不足。最后敲除了ygeX基因，并不能解除L-DAP在培养基中浓度的降低，说明ygeX基因在大肠杆菌中表达较弱，对L-DAP降解不明显。
　　5、试图利用反义RNA干扰调控TCA循环，设计了三个不同的靶向序列干扰eno基因，成功构建pCS-SerA-SerC-EnoasRNA载体。产量并未达到预期结果。建立了特定的颜色反应测定L-DAP浓度，确定30min为颜色反应终止时间。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．2 氨基酸的生物合成

1．3 相关合成途径介绍

1．3．1 金黄色葡萄球菌中L-2，3-二氨基丙酸合成途径

1．3．2 苏云金芽孢杆菌中L-2，3-二氨基丙酸合成途径

1．4 3-磷酸甘油酸脱氢酶(PGDH)抗反馈抑制突变

1．5 Red重组技术

1．5．1 Red重组作用机理

1．5．2 Red同源重组功能质粒

1．5．3 Red同源重组技术方法

1．6 反义RNA干扰技术及应用

1．7 本课题的研究内容

第二章 合成L-2，3-二氨基丙酸外源酶基因的筛选

2．1 实验材料

2．1．1 载体和菌株

2．1．2 培养基

2．1．3 实验仪器与试剂

2．2 实验方法

2．2．1 引物设计

2．2．2 细菌基因组提取

2．2．3 质粒提取

2．2．4 PCR反应

2．2．5 胶回收

2．2．6 柱回收

2．2．7 酶切

2．2．8 连接体系

2．2．9 大肠杆菌化学法转化

2．2．10 重组质粒的筛选

2．2．11 目的蛋白的表达

2．2．12 目的蛋白的纯化

2．2．13 产物测定方法

2．3 实验结果与分析

2．3．1 外源路径的设计

2．3．2 重组质粒的构建

2．3．3 目的蛋白的纯化结果

2．3．4 外源酶实转化实验

2．4 本章小结

第三章 合成L-2，3-二氨基丙酸大肠杆菌的构建及优化

3．1 实验材料

3．1．1 载体和菌株

3．1．2 培养基

3．2 实验方法

3．2．1 引物设计

3．3．2 质粒提取

3．2．3 PCR反应

3．2．4 胶回收

3．2．5 柱回收

3．2．6 酶切

3．2．7 连接体系

3．2．8 大肠杆菌化学法转化

3．2．9 Red重组

3．2．10 化转感受态细胞的制备

3．2．11 发酵实验方法

3．3 实验结果与分析

3．3．1 重组质粒构建以及BW25113发酵

3．3．2 过表达上游基因敲除支路基因提高前体供应

3．3．3 发酵菌株优化

3．3．4 serA抗反馈抑制突变(A345C G359C)

3．3．5 模块优化

3．3．6 发酵条件优化

3．3．7 引入谷氨酸脱氢酶基因(gbhA)

3．3．8 L-2，3-二氨基丙酸毒性实验

3．3．9 L-2，3-二氨基丙酸降解实验探究

3．4 本章小结

第四章 利用反义RNA干扰调控三羧酸循环

4．1 实验材料

4．1．1 载体和菌株

4．1．2 培养基

4．1．3 实验仪器与试剂

4．2 实验方法

4．2．1 引物设计

4．2．2 质粒提取

4．2．3 PCR反应

4．2．4 胶回收

4．2．5 柱回收

4．2．6 酶切

4．2．7 连接体系

4．2．8 大肠杆菌化学法转化

4．2．9 大肠杆菌化转感受态细胞的制备

4．3 实验结果与分析

4．3．2 pCS-SerA-SerC-EnoasRNA质粒的构建

4．3．3 BW△serB(pZE-SbnA-SbnB，pCS-SerA-SerC-EnoasRNA)菌株发酵

4．3．4 颜色反应法检测产物

4．4 本章小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

附录

致谢

研究成果及发表的学术论文

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