三孢布拉氏霉菌对乙烯代谢响应机制研究

摘要

三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）是一种接合生殖的丝状真菌。B.trispora的天然菌株能够发酵生产类胡萝卜素，因此在食品工业上常使用B.trispora发酵生产抗氧化剂。本研究发现，植物激素乙烯可以促进B.trispora中β-胡萝卜素的产生，本研究采用基于二维蛋白电泳的蛋白质组学方法结合代谢组学数据，共发现31个代谢物和9个蛋白质与B.trispora对乙烯的响应有关。这些代谢物和蛋白质主要参与三羧酸循环(TCA)，碳水化合物代谢，氨基酸代谢，脂肪酸代谢和甲羟戊酸途径等过程。研究结果表明，乙烯导致TCA循环代谢流的下降和乙酰辅酶A的积累，这有助于代谢流向产生β-胡萝卜素的方向移动。同时乙烯诱导了甲羟戊酸途径中hmgR，ipi，carG，carRA和carB等关键基因的转录上调，直接带来了β-胡萝卜素产量增加。
　　为了更全面地了解乙烯对B.trispora的转录调控，本研究还对B.trispora进行基于RNA-seq测序的基因转录组学分析，在B.trispora中拼接出总共27095个转录本。通过差异表达基因分析，B.trispora对乙烯的转录响应主要发生在稳定期，乙烯能够诱导菌体提前进入稳定期。KEGG通路富集分析结果表明，乙烯很可能引起了细胞的氧化应激反应。通过分析胞内丙二醛水平，超氧化物歧化酶活性和过氧化氢酶活性，进一步证实在乙烯处理后，B.trispora中氧化压力增加，导致了氧化应激反应的产生和β-胡萝卜素含量增加。这项研究为进一步揭示B.trispora对乙烯响应的分子机制并实现β-胡萝卜素高产提供了丰富的信息。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2．2 β-胡萝卜素的合成途径

1．3 乙烯的介绍

1．3．1 乙烯的性质

1．3．2 乙烯对植物的调控

1．3．3 乙烯信号在植物体内的传导

1．4 关于B．trispora发酵生产β-胡萝卜素的研究进展

1．5．1 研究目的与意义

1．5．2 研究内容

1．5．3 研究方法

1．6 本课题的创新之处

第二章 乙烯对B．trispora发酵的影响

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 实验菌种与培养基

2．2．2 仪器与试剂

2．3 实验方法

2．3．1 菌种的活化

2．3．2 菌种的发酵培养

2．3．3 生物量的测量

2．3．5 发酵液中葡萄糖含量的测定

2．3．6 菌体内乙酰辅酶A含量的测定

2．4 结果与讨论

2．4．2 乙烯对B．trispora生长的影响

2．4．3 乙烯对B．trispora碳源利用的影响

2．4．4 乙烯对菌体中乙酰辅酶A含量的影响

2．5 小结

第三章 B．trispora在蛋白水平对乙烯的响应

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 菌种和培养基

3．2．2 主要试剂及仪器

3．3 实验方法

3．3．1 提取总蛋白

3．3．2 Bradford法定量蛋白

3．3．3 二维电泳

3．3．4 银染染色

3．3．5 凝胶图像分析及差异蛋白鉴定

3．3．6 差异蛋白点编码基因的荧光定量PCR

3．4 结果与讨论

3．4．1 总蛋白的提取

3．4．2 蛋白样品制备的条件优化

3．4．3 银染染色条件的优化

3．4．4 乙烯对B．trispora蛋白表达的影响

3．4．5 2-DE差异蛋白的荧光定量实验

3．4．6 甲羟戊酸途径关键基因的荧光定量实验

3．4．7 B．trispora对乙烯的代谢响应

3．5 小结

第四章 B．trispora在转录水平对乙烯的响应

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 菌种与培养基

4．2．2 仪器与试剂

4．3 实验方法

4．3．4 差异基因的荧光定量PCR验证

4．3．5 MDA、SOD、CAT含量的测定

4．4 结果与讨论

4．4．1 总RNA提取的质量分析

4．4．2 转录本的测序及组装结果

4．4．3 转录本NR库功能注释

4．4．4 基因表达差异及表达模式聚类

4．4．5 差异基因的荧光定量验证

4．4．6 差异基因(DEGs)的GO功能注释

4．4．7 差异基因KEGG通路分析

4．4．8 B．trispora对乙烯的氧化应激

4．5 小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

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