大肠杆菌利用蔗糖高效合成D-葡萄糖二酸的研究

摘要

D-葡萄糖二酸是用于合成其他增值化学品或商品化学品的一种很有前景的平台化合物。目前部分化学法合成D-葡萄糖二酸已投入生产，微生物方面研究还不够成熟。在代谢工程大肠杆菌中尝试将D-葡萄糖转化为D-葡萄糖二酸的方法已经探究了很多年。其中，单糖发酵的效果不明显，得率很低，后期分离纯化困难。在混糖发酵中D-葡萄糖二酸产量增加，正因如此这种方法之后获得了研究者极大的关注。在此，我们在大肠杆菌BL21(DE3)中共同表达cscB，cscA，cscK，ino1，miox，udh和suhB7个基因，分别是蔗糖关键基因和代谢目的产物的关键基因。从功能上构建从蔗糖到D-葡萄糖二酸的途径，该途径目前还未经报导。之后运用Red重组和Crispr/Cas9技术进一步敲除zwf,pgi，ptsG，uxaC，gudD等5个代谢路径关键基因，并且过表达基因glk，弥补D-葡萄糖磷酸化缺失路径，以及使用D-果糖依赖性的翻译控制系统用于调控基因pgi，测定不同时期Pgi的酶活，以达到调控碳通量的目的。以上方式最终使得重组大肠杆菌既可使用蔗糖作为唯一碳源，同时可获得较高的产量。在发酵过程中，发现，D-葡萄糖二酸在含有～10g/L蔗糖的M9培养基中的产量达到～1.42g，以蔗糖为底物时产量为～0.142g/g。

目录

声明

摘要

1．1 简介

1．1．2 D-葡萄糖二酸的应用

1．2 国内外研究进展

1．2．1 化学法生产D-葡萄糖二酸

1．2．2 生物法合成D-葡萄糖二酸

1．3 检测方法探究

1．4 论文的研究意义和研究方法

1．4．1 研究意义

1．4．2 研究思路

第二章 蔗糖利用和D-葡萄糖二酸合成途径构建

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 菌株和质粒

2．2．2 培养基、引物、酶与实验试剂

2．2．3 实验仪器

2．3．1 质粒构建方法

2．3．2 重组大肠杆菌发酵

2．3．3 生物量检测

2．3．4 发酵产物D-葡萄糖二酸和残糖的分析检测

2．4 实验结果与讨论

2．4．1 基因克隆与质粒构建

2．4．2 重组大肠杆菌发酵

2．5 本章小结

第三章 葡萄糖和D-葡萄糖二酸副产物代谢途径敲除

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 菌株和质粒

3．2．2 培养基、引物、酶与实验试剂

3．2．3 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 敲除方法示意图

3．3．2 磷酸戊糖途径基因(zwf)的敲除

3．3．3 糖酵解途径基因(pgi)的敲除

3．3．4 糖醛酸异构酶(uxaC)的敲除

3．3．6 葡萄糖特异性酶(ptsG)的敲除

3．3．7 原始菌与重组菌发酵

3．3．8 生物量检测

3．4．1 λ-red重组系统基因敲除

3．4．2 crispr／cas9试剂盒敲除

3．4．3 重组菌发酵

3．4．5 glk基因构建优化

3．5 本章小结

第四章 基于RNA水平调控对合成D-葡萄糖二酸的影响

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 菌株和质粒

4．2．2 培养基、引物、酶与实验试剂

4．2．3 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 overlap PCR构建方法

4．3．2 质粒构建方法

4．3．3 重组大肠杆菌发酵

4．3．4 生物量检测方法

4．3．5 绿色荧光蛋白(eGFP)测定方法

4．3．6 pgi蛋白酶活测定方法

4．4 实验结果与讨论

4．4．1 基因克隆与质粒构建

4．4．2 发酵液荧光测定

4．4．3 pgi蛋白酶活测定

4．4．4 逻辑开关优化后的发酵

4．5 本章小结

第五章 结论与建议

参考文献

研究成果及发表的学术论文

致谢

导师和作者简介