基于外周血单个核细胞代谢组学的柴归颗粒抗抑郁作用机制研究

摘要

抑郁症是全球常见的精神类疾病，以明显持久的负面情绪状态为特征，具有很高的发病率、复发率和致残率。大量研究表明免疫与抑郁症的发生发展密切相关，抑郁症的根源或许在于免疫，抑郁的发生是机体免疫系统对大脑发出的警告。外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs）是由外周血中具有单个核的细胞组成，包括淋巴细胞和单核细胞，以淋巴细胞为主，是机体免疫应答功能的重要组成部分。诸多研究表明，疾病状态时PBMCs可穿过血脑屏障进入中枢神经系统，参与大脑内的生理病理过程，且其细胞功能及分子表达特征亦可反映中枢神经系统的生理病理状态。因此，将外周血单个核细胞用于抑郁症的研究，相比于脑，具有临床采样安全便捷、患者接受度高、可动态观察疾病进展情况等显著优势，更适用于临床抑郁症病人的诊断和抗抑郁药物疗效评价及作用机制研究。代谢组学是指对某一生物或细胞在一定时期内产生的所有低分子量代谢物进行定性或定量分析的一门学科，代谢组学可反映生物或细胞的代谢过程和代谢水平的特征,从小分子层面解释生物机体的变化。因此，基于PBMCs代谢组学可成为研究抑郁症发病机制及抗抑郁药物作用机制的切入点。柴归颗粒是本课题组在挖掘抗抑郁经典名方逍遥散科学内涵的基础上研发的抗抑郁新药，已经获得国家药品监督管理局新药审批中心批准正在开展药物临床试验研究。然而，柴归颗粒的抗抑郁作用机制是否与调节机体的免疫功能有关尚不十分明确，因此本文以PBMCs作为切入点，从免疫功能角度研究柴归颗粒的抗抑郁作用，对柴归颗粒的新药开发及临床应用具有重要意义。　　目的：　　1.明确柴归颗粒发挥抗抑郁作用是否与调节抑郁大鼠PBMCs代谢异常作用相关。　　2.明确柴归颗粒对抑郁大鼠免疫功能的调节作用，并研究该药调节PBMCs代谢紊乱与调节免疫二者之间的关系。　　方法：　　1.首先建立慢性温和不可预知应激(CUMS)抑郁大鼠模型，以大鼠外周血单个核细胞为主要分析对象进行代谢组学研究，采用非靶标的LC-MS代谢组学采集代谢物数据，结合多元统计等分析方法发现CUMS抑郁大鼠模型组与正常对照组差异代谢物。同时，筛选出PBMCs中与抑郁症关联密切的特征标志物。在此基础上，分析药物治疗抑郁症后回调的差异代谢物，并将PBMCs代谢组学找出的差异代谢物进行进一步分析，通过代谢通路分析寻找柴归颗粒发挥抗抑郁作用的关键代谢途径。　　2.采用流式细胞仪检测外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+比例的水平，同时采用酶联免疫测定（ELISA）法，测定血清中免疫球蛋白IgG、IgM和炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的含量，以阐明柴归颗粒对CUMS造模引起的免疫功能下降的调节作用。　　3.PBMCs主要由包括淋巴细胞和单核细胞组成，是免疫系统重要组成部分。因此选择柴归颗粒调节的PBMCs代谢物和免疫功能相关指标进行分析，进一步筛选出与CUMS抑郁大鼠的免疫功能更加密切相关的差异代谢物，然后利用生物信息学手段对筛选得到的关键代谢物进行分析，构建相关生物网络进一步探讨柴归颗粒的抗抑郁作用机制。　　结果：　　1.通过PBMCs代谢组学，筛选出正常组和CUMS抑郁模型组之间与抑郁症相关的差异代谢物25种。与正常组相比，CUMS模型组大鼠PBMCs中升高的代谢物有5种，降低的有20种。其中柴归颗粒给药后能显著回调其中的14种，代谢通路分析显示，在大鼠PBMCs中与抑郁症相关的代谢通路，主要包括：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；酪氨酸代谢；醚脂代谢；嘌呤代谢。柴归颗粒能有效地调节PBMCs中嘌呤代谢和醚脂代谢途径。　　2.与健康正常组大鼠相比，CUMS抑郁模型组大鼠外周血CD4+T淋巴细胞数目和CD4+/CD8+T淋巴细胞比例（P0.05）降低，CD8+T淋巴细胞有升高趋势。与CUMS组相比，柴归颗粒给药治疗后能明显增加外周血淋巴细胞中CD4+T细胞数量和CD4+/CD8+T淋巴细胞比例（P0.05）。血清免疫球蛋白IgG和IgM水平的检测结果显示，CUMS抑郁模型组大鼠血清中IgG、IgM水平均低于正常组大鼠(P＜0.05)，柴归颗粒治疗后IgG、IgM水平均较模型组升高（P＜0.05）。血清炎性细胞因子的检测结果显示，与正常组相比，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6（P＜0.01）水平升高，抗炎细胞因子IL-10（P＜0.01）的水平降低。柴归颗粒治疗后，炎症细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6(P＜0.05)的水平降低，抗炎细胞因子IL-10(P＜0.05)的分泌增加。以上结果表明，柴归颗粒可以通过改善免疫功能，缓解免疫炎症发挥抗抑郁作用。　　3.相关分析表明，在柴归颗粒调节的差异代谢物中，13种与免疫相关指标密切相关。对13种与免疫相关的代谢物进一步网络分析表明嘌呤代谢可能是柴归颗粒在抑郁大鼠PBMCs中发挥抗抑郁作用的重要通路，嘌呤代谢途径上的NT5E、NT5C1B、NT5C2、PDE11A、PDE10A、PDE2A、AMPD2、AMPD3、ADK和PDE3A等10个靶点可能是柴归颗粒发挥抗抑郁作用的潜在关键靶点。　　结论：　　我们的研究结果表明，柴归颗粒可能通过调节PBMCs的嘌呤代谢途径，进而改善免疫功能来发挥抗抑郁作用。本研究以PBMCs代谢组学为切入点，研究中药复方的抗抑郁机制，为阐明中药方剂的作用机制提供了新的思路。

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