某中医院铜绿假单胞菌的耐药情况及其耐碳青霉烯类相关耐药基因分析的研究

摘要

背景与目的　　铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)广泛分布于医院各科室，尤其是在重症护理监护病房（IntensiveCareUnit,ICU）、呼吸科以及烧伤科、老年病房。该菌是一种条件致病菌，通常情况下不会感染人体任何组织，但是当定植部位改变或者病人手术、化疗等因素引起自身免疫力降低时，则致使病人感染。PA可引起肺部感染、败血症、泌尿系统感染、创伤面感染等。近年来，出现了多重耐药(multi-drugresistance,MDR)、广泛耐药(extensively-drugresistancebacteria,XDR)甚至泛耐药（pan-drugresistance,PDR）的PA,并且其耐药率显著升高，究其原因，大致为抗生素的管理疏忽、滥用日益严重，结合PA的固有耐药机制与获得耐药机制复杂并存。针对这些问题，医疗部门逐渐重视并积极研究对策。　　碳青霉烯类抗生素具有独特的反式构象使其具有很强的稳定性与超广谱的抗菌活性，对多种细菌具有很强的杀菌作用且对β-内酰胺酶具有高度稳定性是临床治疗铜绿假单胞菌感染的最有效手段之一。但是，随着此类抗生素的使用过分频繁，PA菌株对碳青霉烯类药物的耐药现象也逐渐增加，耐药率逐年增高，临床对于此类耐药细菌的感染几乎是无药可用。　　铜绿假单胞菌针对碳青霉烯类的耐药机制非常复杂，其中最重要的机制就是产金属β-内酰胺酶以及通道蛋白的缺失。　　鉴于国内外针对铜绿假单胞菌耐药性的研究与报道，我们设计了本课题，旨在：1．通过分析医院近两年铜绿假单胞菌的耐药情况掌握中医院铜绿假单胞菌的耐药特点，指导临床医生合理使用抗生素、预防和控制院内感染的发生。　　2．探究产金属酶耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌所携带的金属β-内酰胺酶基因类型以及菌株通道蛋白OprD2表达状况，初步揭示铜绿假单胞菌耐药机制，流行的耐药基因类型，为临床抗感染治疗提供有力的实验依据。　　方法　　1．统计比较　　统计泰安市中医医院2016年9月到2018年6月间的铜绿假单胞菌的数据，利用WHONET5.6软件进行分析。用卡方检验进行统计学比较碳青霉烯类抗生素敏感株与耐药株之间其他抗生素耐药率的差异，以半年为间隔进行纵向耐药率变迁的比较，以年龄分组进行标本类型、科室来源及耐药率的比较。　　2．表型确证　　将分离的耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌菌株复苏后采用EDTA双纸片增效试验筛查产金属β-内酰胺酶的铜绿假单胞菌。　　3．基因检测　　用特定引物序列，采用聚合酶链式反应（PCR），扩增金属β-内酰胺酶基因IMP、VIM及OprD2通道蛋白基因得到扩增产物后进行凝胶电泳。将阳性产物送睿博兴科(青岛)测序部进行测序，测序结果进行BLAST比对分析。　　结果　　1．统计分析比较　　2016年9月到2018年6月间共检出铜绿假单胞菌204株，主要来源科室为ICU（30%）、呼吸科（18%）、脑病康复科（17%）等。标本来源主要为痰标本占比89%。　　耐药率分析可知耐药情况严重，其中碳青霉烯类抗生素敏感组与其耐药组的进行其他抗生素类型耐药率统计学比较均有差异。按照半年期进行分析发现某些抗生素的耐药率逐渐呈现下降趋势。按照年龄分组（以60岁为界）进行标本类型、科室来源及耐药率的比较存在一定差异化。　　2．表型确证　　双纸片增效试验筛查结果表明，89株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌中有20株为产金属β-内酰胺酶基因阳性菌株。　　3．基因型检测　　（1）89株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌中IMP12株，VIM0株，产金属β-内酰胺酶率为13.5%。　　（2）89耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌中，32株扩增出通道蛋白OprD2,57株菌株未扩增到通道蛋白OprD2，通道蛋白OprD2缺失率为60.1%。　　（3）扩增出的阳性基因产物外送进行基因测序，并将测序结果与基因库比对，序列相似性达到97%以上。　　结论　　1．铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物整体耐药率在40%以上比较严重。统计分析得出老年人所感染PA在碳青霉烯类药物的耐药率上要显著高于中青年。　　2．CR-PA对所有抗生素的耐药率均显著高于CS-PA，结合CR-PA的高检出率，应当引起临床足够重视。　　3．按照时间分组统计比较得出，部分抗生素在医院加强抗菌药物的管理后耐药率明显降低。　　4．89株耐碳青霉烯类药物铜绿假单胞菌，得20株金属酶阳性菌株。可见耐碳青霉烯类抗生素铜绿假单胞菌的耐药机制复杂多样。20株金属酶阳性菌株扩增出12株IMP基因，可见本地区金属酶主要是以IMP基因流行为主。　　5．89株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌通道蛋白Oprd2缺失率达到了60.1%，可见泰安地区分离PA对碳青霉烯类耐药的主要机制与通道蛋白Oprd2的缺失有很大关联。

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