调节性B细胞亚群与系统性红斑狼疮发病的关系及其机制研究

摘要

调节性B细胞（RegulatoryBcells,Bregs）是以负性调节功能为特征的B细胞亚群，具有抑制炎症免疫反应、预防自身免疫反应的调节作用，参与多种免疫病理过程。Bregs既可通过分泌大量的抑制性细胞因子以浓度依赖的方式，亦可通过连接负性共刺激因子以接触依赖的方式发挥其功能。Bregs在包括自身免疫性疾病在内的多种疾病发病过程中扮演着重要角色。但Bregs在SLE病程中的分布规律、对于免疫细胞的影响以及免疫调节功能的作用机制目前尚不明确。　　目的：　　（1）明确SLE患者外周血Bregs亚群的表达情况及分布特点，比较SLE患者中Bregs的功能变化，分析Bregs亚群与SLE临床指标的相关性。　　（2）明确治疗前后SLE患者外周血Bregs的转归。　　（3）探索Bregs及其功能分子对CD4+T细胞分化、增殖以及功能的影响，探讨Bregs参与SLE疾病发生发展的可能机制。　　方法：　　（1）选取新发初治的SLE患者（n=72），同时选取年龄、性别匹配的健康对照，统计SLEDAI-2K、补体、血沉、C反应蛋白、尿蛋白等临床指标。　　（2）通过流式细胞术对外周血Bregs亚群、B细胞亚群、Th细胞亚群等细胞群的表达和分布进行分析，利用细胞内染色流式对Bregs亚群进行功能分析。应用ELISA技术测定了外周血中IL-10、IL-35、TGF-β1以及BAFF水平，CBA技术测定Th细胞功能分子水平。　　（3）分析Bregs亚群与SLE临床指标之间的相关性。　　（4）随访规范治疗的SLE患者，研究治疗前后Bregs亚群细胞水平和IL-10、IL-35、TGF-β1水平的变化。　　（5）通过在体外模拟SLE患者Bregs与CD4+T细胞的作用环境，建立transwell 共培养体系，研究SLE中Bregs对CD4+T细胞的影响及其可能的作用机制。　　结果：　　（1）流式细胞术分析发现，SLE患者外周血中IL-10+Bregs以及IL-35+Bregs亚群细胞比例降低，TGF-β1+Bregs比例无明显变化。CD19+CD24hiCD38hi过渡期Bregs和CD19+CD24hiCD27+记忆Bregs细胞比例减低。CD19+CD24hiCD38hiBregs在外周血总CD3?CD19+B细胞中的比例要低于CD19+CD24hiCD27+Bregs。相关性分析发现，SLE患者外周血IL-10+Bregs的比例与CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈明显正相关，IL-35+Bregs的比例与CD19+CD24hiCD38hiBregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈明显正相关。　　（2）SLE患者血浆中IL-35、TGF-β1水平明显减低，IL-10水平升高。IL-35水平与IL-35+Bregs亚群比例、CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例明显相关。　　（3）体外细胞培养试验表明，SLE患者CD19+CD24hiCD27+Bregs产IL-10以及IL-35水平均高于CD19+CD24hiCD38hiBregs。　　（4）SLE患者外周血中Th17细胞的频率明显升高，血浆中TNF-α、IL-6、IL-17A、BAFF等细胞因子水平升高，IL-2水平降低。SLE患者血浆中IL-17A水平与外周血中Th17细胞的频率呈正相关，BAFF水平与外周血CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈负相关。　　（5）SLE患者CD27+CD38?/loMB、CD27+CD38hiPB和CD27?CD38hiTB的频率增高，CD27?CD38?/lonaiveB细胞的频率下降。IL-35+Bregs亚群比例与CD27+CD38?/loMB、CD27?CD38?/lonaiveB细胞比例负相关。TGF-β1+Bregs亚群比例与CD27+CD38hiPB细胞比例负相关。CD19+CD24hiCD38hiBregs亚群比例与CD27?CD38?/lonaiveB细胞比例正相关。CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例与CD27?CD38hiTB细胞比例负相关。　　（6）临床指标相关性分析发现，SLE患者外周血的IL-35+Bregs亚群比例与ESR呈负相关，IL-10+Bregs亚群比例与CRP呈负相关。IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD38highBregs亚群比例与血清中C3水平呈正相关。外周血的IL-10+Bregs亚群比例与血清中C4水平呈正相关。外周血的IL-10+Bregs、IL-35+Bregs亚群比例与SLE疾病活动性评分SLEDAI水平呈负相关。　　（7）与轻中度活动的SLE患者相比，重度疾病活动的SLE患者IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例明显降低。　　（8）与不伴有肾脏受累的患者相比，伴有狼疮性肾炎SLE患者的IL-10+Bregs、IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例以及IL-35水平明显降低。　　（9）经激素及免疫抑制治疗后，IL-10+Bregs、IL-35+Bregs以及CD19+CD24hiCD38hiBregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs细胞频率，IL-10、IL-35水平较基线升高。　　（10）Transwell共培养CD19+B细胞与CD4+T细胞实验发现，健康人Bregs可抑制SLE患者Th1、Th17细胞水平，这种功能的发挥不完全依赖于细胞间的接触，但细胞间的接触可以强化这种抑制作用。健康人Bregs可抑制SLE患者Th1、Th17细胞功能。IL-10mAb或rIL-35的刺激均可明显增强Bregs对Th细胞及其功能的抑制作用。SLE患者Bregs对健康人Th细胞的抑制作用受损。IL-10mAb、rIL-35可以协助SLE患者受损的Bregs恢复对Th1、Th17细胞水平及功能的抑制作用。Th细胞IL-2、IFN-γ及IL-6的产生，在一定程度上受到IL-10和IL-35的调控。　　结论：　　（1）SLE患者外周血IL-10+Bregs、IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD38hiBregs以及CD19+CD24hiCD27+Bregs细胞比例减低，产生IL-35、TGF-β1功能减弱。Bregs分泌功能的发挥主要以CD19+CD24hiCD27+Bregs为主。　　（2）外周血IL-10+Bregs、IL-35+Bregs以及CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例、IL-35水平的降低可能与SLE患者合并LN有关。　　（3）SLE患者经有效治疗后，其外周血Bregs和IL-10、IL-35水平可部分恢复。　　（4）健康人Bregs可抑制SLE患者Th1、Th17细胞水平及细胞功能，IL-10mAb或rIL-35的刺激均可明显增强Bregs的抑制作用。　　（5）SLE患者Bregs抑制功能受损。IL-10mAb、rIL-35可以协助SLE患者受损的Bregs恢复功能。　　（6）Th细胞IL-2、IFN-γ及IL-6的产生，在一定程度上受到IL-10和IL-35的调控。

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