长链非编码RNA RP24-315D19.10在小鼠子宫内膜蜕膜化中的作用及机制研究

摘要

目的：　　长链非编码RNAs（lncRNAs）通常是指长度200nt且不具有蛋白编码功能的一类转录本。lncRNAs可在各个关键的生物学过程中发挥重要的作用，其作用模式复杂多样。目前已发现有若干与子宫内膜蜕膜化相关的lncRNA分子，如LINC00473、CD36-005、TUNAR、HOXA11-AS、HOTAIR、Hand2os1、HK2P1和PGK1P2等。研究显示，这些在妊娠早期子宫内膜蜕膜化过程中表达异常的lncRNA分子直接或间接参与了蜕膜化的发生发展。然而，lncRNAs在子宫内膜蜕膜化中的潜在分子调控机制仍不明确。因此，本研究旨在从表观遗传学的角度探究lncRNAs在小鼠子宫内膜蜕膜化中的作用及其调控机制，为后续lncRNAs在蜕膜化中的功能研究提供实验依据。　　方法：　　1.采用RNA测序技术对小鼠孕第6天（D6）胚胎着床点和着床旁子宫内膜组织中的lncRNAs和mRNAs的表达进行检测和分析。　　2.采用加权基因共表达网络分析方法对RNA测序数据进行深度分析，获得与小鼠子宫内膜蜕膜化显著相关的核心lncRNAs。　　3.分别构建正常妊娠小鼠模型、假孕小鼠体内人工诱导蜕膜化模型和原代小鼠子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化模型，通过RT-qPCR对核心lncRNAs在以上3个模型中的表达进行分析，获得目标研究对象lncRNARP24-315D19.10。　　4.利用RP24-315D19.10-siRNA构建小鼠子宫内膜基质细胞RP24-315D19.10干扰模型，采用F-actin染色、RT-qPCR、细胞免疫荧光、TUNEL染色和Westernblot对RP24-315D19.10-siRNA干扰后的基质细胞在蜕膜化过程中的形态改变、蜕膜化标志分子的表达、细胞增殖及凋亡水平进行检测分析。　　5.对RP24-315D19.10互作蛋白进行筛选：①采用RNAFISH和细胞核/质RNA分离技术分析RP24-315D19.10的亚细胞定位；②采用RNApull-down结合蛋白质谱分析技术预测筛选RP24-315D19.10的互作蛋白；③采用RNA免疫共沉淀验证RP24-315D19.10与候选蛋白hnRNPA2B1的互作；④采用Westernblot检测hnRNPA2B1在RP24-315D19.10干扰模型中的表达。　　6.对hnRNPA2B1在蜕膜化中的作用进行研究：①利用hnRNPA2B1-siRNA构建小鼠子宫内膜基质细胞hnRNPA2B1干扰模型，采用F-actin染色、Westernblot对hnRNPA2B1-siRNA干扰后的基质细胞在蜕膜化过程中的形态改变、蜕膜化标志分子的表达、细胞增殖及凋亡标志分子的表达进行检测分析；②利用RP24-315D19.10-siRNA干扰小鼠子宫内膜基质细胞内RP24-315D19.10表达的同时，使用质粒过表达hnRNPA2B1，之后采用F-actin染色、Westernblot对hnRNPA2B1过表达后的基质细胞在蜕膜化过程中的形态改变、蜕膜化标志分子的表达、细胞增殖及凋亡标志分子的表达进行检测分析；③采用免疫组化、Westernblot检测hnRNPA2B1在正常妊娠和自然流产患者子宫蜕膜组织中的表达水平。　　7.对RP24-315D19.10的功能性位点进行预测分析：①采用catRAPID数据库预测RP24-315D19.10和hnRNPA2B1的结合位点；②采用UCSC数据库对RP24-315D19.10进行同源序列比对，得到与RP24-315D19.10具有同源序列的人lncRNATRAM2-AS1；③采用RT-qPCR检测人lncRNATRAM2-AS1在正常妊娠和自然流产患者子宫蜕膜组织中的表达水平。　　结果：　　1.RNA测序分析结果显示，在D6小鼠胚胎着床点子宫内膜组织中共有21个差异表达的lncRNAs，其中7个上调、14个下调，以及586个差异表达的mRNAs，其中312个上调、274个下调（|log2FC|?1，P0.05）。进一步的GO和KEGG分析结果提示这些差异表达的lncRNAs和mRNAs可能参与小鼠子宫内膜蜕膜化。　　2.通过WGCNA分析，从复杂的RNA测序数据中筛选出4个核心lncRNAs，即2010204K13Rik、Gm26737、Gm4258以及RP24-315D19.10。　　3.RT-qPCR结果显示候选目标lncRNARP24-315D19.10在小鼠子宫内膜蜕膜化中表达上调。　　4.蜕膜化相关指标分析结果显示，在体外诱导蜕膜化过程中，干扰RP24-315D19.10导致基质细胞骨架重塑失败，蜕膜化标志分子Dtprp、Cox-2、BMP2和增殖标志分子Ki-67、PCNA的表达，以及凋亡标志分子Bcl2/Bax的比值均显著下调，提示干扰RP24-315D19.10可显著抑制小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化。　　5.RNAFISH和细胞核/质RNA分离实验结果表明RP24-315D19.10定位于细胞质中。进一步的RP24-315D19.10互作蛋白的相关分析结果显示，RP24-315D19.10与hnRNPA2B1直接结合并上调hnRNPA2B1的表达。　　6.蜕膜化相关指标分析结果显示，在体外诱导蜕膜化过程中，干扰hnRNPA2B1导致基质细胞骨架重塑失败，蜕膜化标志分子Cox-2、BMP2和增殖标志分子PCNA的表达以及凋亡标志分子Bcl2/Bax的比值均显著下调，而过表达hnRNPA2B1可以逆转干扰RP24-315D19.10所致的蜕膜化损伤表现。相比于正常妊娠者，hnRNPA2B1在自然流产患者子宫蜕膜组织中的表达显著降低。以上结果提示，hnRNPA2B1参与调控子宫内膜蜕膜化。　　7.catRAPID分析和同源序列比对结果显示，143-167核苷酸位点可能是RP24-315D19.10的功能性位点，与此位点序列具有同源序列的人lncRNATRAM2-AS1在自然流产患者子宫蜕膜中的表达较正常妊娠者显著增高。　　结论：　　lncRNARP24-315D19.10通过上调hnRNPA2B1促进小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化。

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