高亮度的单体化远红光与近红外藻胆蛋白荧光探针的研究

目录

声明

缩略词表

1 序言

1.1 蓝细菌的光合作用

1.1.1 藻胆体及其能量传递机制

1.1.2 藻胆蛋白

1.1.3 胆色素及其生物合成

1.1.4 藻胆蛋白的生物合成

1.1.5 连接蛋白

1.2 光敏色素

1.3 荧光蛋白的研究进展

1.3.1 绿色荧光蛋白家族

1.3.2 橙红色荧光蛋白家族

1.3.3 结合胆绿素的近红外荧光蛋白

1.4 超分辨显微技术

1.5 本课题研究目的与意义

2 基于7335ApcE2 与7203ApcF2 嵌合的近红外荧光探针研究

2.1 引言

2.2 材料与仪器

2.2.1 主要材料

2.2.2 培养基与试剂

2.2.3 主要实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 定点诱变和缺失诱变

2.3.2 制备感受态细胞

2.3.3 蛋白的表达与纯化

2.3.4 吸收和荧光光谱的测定

2.3.5 摩尔消光系数、荧光量子产率及分子亮度的测定

2.3.6 序列比对

2.3.7 三维结构的模拟

2.3.8 色素的萃取

2.3.9 荧光寿命的测定

2.3.10 融合基因表达质粒的构建

2.3.11 融合基因标记质粒的构建

2.3.12 动物细胞的复苏、培养与转染

2.3.13 荧光蛋白在动物细胞内亮度的测定

2.3.14 蛋白浓度和色素浓度的测定

2.3.15 蛋白pH稳定性的测定

2.3.16 蛋白热稳定性的测定

2.3.17 蛋白聚集态的体外分析

2.3.18 蛋白聚集态的体内分析

2.3.19 正置荧光显微镜对色素蛋白的成像

2.3.20 蛋白标记细胞的SIM成像

2.4 结果与分析

2.4.1 由ApcE2进化的可溶性藻胆蛋白BDFP3的获得

2.4.2 色素PФB制备产量的提高

2.4.5 FRET提高融合蛋白在细胞内有效亮度的研究

2.4.6 融合蛋白聚集态的分析

2.4.7 融合蛋白稳定性的分析

2.4.8 融合蛋白在哺乳动物细胞中超分辨成像

2.5 小结与讨论

3 基于7335ApcE2 与7203ApcF2 嵌合的远红光荧光探针研究

3.1 引言

3.2 材料与仪器

3.2.1 主要材料

3.2.2 培养基与试剂

3.2.3 主要实验仪器

3.3 实验方法

3.3.1 蛋白的表达与纯化

3.3.2 吸收和荧光光谱的测定

3.3.3 蛋白光谱参数的计算

3.3.4 圆二色光谱的测定

3.3.5 荧光寿命的测定

3.3.6 SDS-PAGE和染色

3.3.7 融合基因表达质粒的构建

3.3.8 融合基因标记质粒的构建

3.3.9 动物细胞的复苏、培养与转染

3.3.10 细胞内亮度的测定

3.3.11 蛋白浓度和色素浓度的测定

3.3.12 色素蛋白的酶解

3.3.13 蛋白pH和热稳定性的测定

3.3.14 蛋白聚集态的体外分析

3.3.15 蛋白聚集态的体内分析

3.3.16 融合蛋白的SIM超分辨成像

3.3.17 高分辨率激光共聚焦扫描显微成像

3.4 结果与分析

3.4.1 可溶性BDFP3非共价结合PEB的研究

3.4.2 极亮的红色荧光蛋白BDFP3.3的获得

3.4.5 FRET提高融合蛋白在细胞内有效亮度的研究

3.4.6 用BDFP3.3的酶解液代替游离的色素PEB

3.4.7 BDFP3.3及其融合蛋白的聚集态分析

3.4.8 BDFP3.3及其融合蛋白的稳定性分析

3.4.9 BDFP3.3及其融合蛋白在哺乳动物细胞中标记成像

3.5 小结与讨论

4 基于ApcF2的远红光单体高亮度荧光蛋白的研究

4.1 引言

4.2 材料与仪器

4.2.1 主要材料

4.2.2 培养基与试剂

4.2.3 主要实验仪器

4.3 实验方法

4.3.1 诱变体库的构建方法

4.3.2 诱变体的蛋白表达与纯化

4.3.3 诱变体的序列鉴定

4.3.4 蛋白的聚集态分析

4.3.5 蛋白的序列比对

4.3.6 三维结构的模拟

4.3.7 诱变体的结晶

4.4 结果与分析

4.4.1 远红光单体BDFPs 的随机诱变筛选结果

4.4.2诱变体的亮度分析

4.4.3诱变体v9的晶体筛选

4.4.4诱变体v9的晶体结构的分析

4.4.5 smURFP晶体结构的分析

4.4.6 基于诱变体v9晶体结构的BDFPs的优化

4.5 小结与讨论

5 论文总结

5.1 本文小结

5.2不足与展望

参考文献

附录1 攻读学位期间发表的学术论文

致谢