TetR家族蛋白SCO3201负调控天蓝色链霉菌抗生素合成机制的研究

摘要

链霉菌是一类善于生产抗生素等次级代谢活性物质的细菌。据统计，超过70%的临床抗生素以及其他用于农业、食品工业等方面的生物活性化合物都产自链霉菌。因此，深入研究链霉菌次级代谢调控机制对医药卫生、工农业等多领域意义重大。目前，已有多达几十个链霉菌菌株(其中多为模式菌株)的全基因组序列被公开，这些信息为在分子水平上更深入地开展链霉菌次级代谢相关研究提供了便利，更重要的是为进一步揭示原本隐藏的、亟待深入挖掘的链霉菌巨大次级代谢产物合成潜力提供了信息平台。　　本研究以模式菌株天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)为研究对象，在前期发现的TetR家族转录调节因子sco3201负调控天蓝色链霉菌次级代谢相关实验结果基础上，深入开展调控机制研究。通过RNA-Seq实验鉴定了SCO3201的过量表达对天蓝色链霉菌全转录组表达的影响。实验结果显示，与对照菌株相比，SCO3201蛋白过表达菌株中大量脂肪酸代谢相关基因以及周边部分TetR基因的表达发生了显著变化，其中，大部分与脂肪酸合成相关基因的表达显著上调(包括sco2387，sco0117，sco3246，sco6564，sco3248等基因)，而与脂肪酸分解相关的基因表达显著下调(包括sco4502，sco6475，sco6787，sco6789，sco6790等基因)。而且，脂肪酸含量检测结果发现，SCO3201蛋白过量表达菌株的脂肪酸含量是对照菌株的2.5倍。　　为进一步探究SCO3201过表达表型与脂肪酸代谢相关途径的具体关联，本研究通过MEME软件预测SCO3201潜在结合位点，并通过EMSA实验证实了SCO3201可与其潜在调控目标基因(包括TetR基因sco0116,sco0430,sco2386,sco4167,sco6792以及脂肪酸合成途径基因sco2390)的启动子区域直接结合，说明过量表达的SCO3201可以采取间接方式，即通过其他TetR转录调控因子传递调控信号，或以直接方式调控脂肪酸合成与分解，最终实现抗生素合成的抑制表型。鉴于抗生素合成及脂肪酸代谢同时需要乙酰辅酶A作为前体分子，所以脂肪酸大量累计而导致的乙酰辅酶A前体分子含量的减少应与SCO3201过表达菌株的抗生素合成抑制表型紧密相关。本论文的实验数据揭示了TetR家族蛋白SCO3201负调控天蓝色链霉菌抗生素合成与脂肪酸代谢的关联机制，研究成果为日后链霉菌次级代谢沉默基因簇表达的激活以及新抗生素开发提供了理论思路和实践依据。

目录

声明

第一章 前言

1 链霉菌简介

2链霉菌代表性次级代谢产物

2.1 次级代谢产物种类

2.2 次级代谢产物的应用

3链霉菌次级代谢调控

3.1链霉菌次级代谢的触发信号

3.2 次级代谢的信号因子

3.3 转录调节因子

3.4 细胞水平调控

4链霉菌的脂肪酸代谢与抗生素生产之间的联系

5 研究的目的与意义

第二章 sco3201过量表达对天蓝色链霉菌转录组表达水平的影响

1 实验材料

1.1菌株及质粒

1.2 溶液配制

2 实验方法

2.1 链霉菌的固体培养

2.2 链霉菌菌体收集和保藏

2.3 链霉菌转录组测序

2.4 RNA-Seq数据分析

3结果

3.1 M145/pWHM3-sco3201生长表型

3.2 RNA-Seq数据分析结果

4小结

第三章 sco3201的原核表达及SCO3201潜在调控靶基因的筛选

第一节sco3201 基因的克隆及原核表达

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 小结

第二节MEME 软件初步筛选SCO3201 潜在调控靶基因

1 实验材料和方法

2 结果

3 小结

第三节确定SCO3201 转录调控靶基因

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 小结

第四章SCO3201对潜在目标基因转录表达的调控作用

1 实验材料

1.1 实验材料

1.2 实验仪器

1.3 实验仪器

2 实验方法

2.1 检测SCO3201调控靶基因表达量的qRT-PCR方法建立

2.2 qRT-PCR验证SCO3201调控的靶基因表达量

3 结果

3.1 荧光定量检测目标基因表达方法建立

3.2 天蓝色链霉菌总RNA提取电泳检测

3.3 sco3201过表达对潜在目标调控靶基因转录的影响

4 小结

第五章 链霉菌中脂肪酸含量的测定

1 实验材料

1.1 实验材料

1.2实验仪器

2实验方法

3 结果

3.1 脂肪酸含量检测结果

4 小结

第六章讨论

讨论

参考文献

在校期间发表论文

致谢