p300通过抑制卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)再激活来促进B细胞淋巴瘤的增殖

摘要

原发性淋巴瘤(primary effusion lymphoma，PEL)是由卡波西肉瘤疱疹相关病毒(Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus，KSHV)引起的B细胞淋巴瘤。目前，关于PEL的致瘤机制尚不清楚。相关研究已表明细胞转录共激活因子p300能够调节宿主与病毒之间的相互作用，从而控制病毒复制过程。在此项研究中，我们探索了p300在KSHV感染的BCBL1细胞中的功能。研究结果显示；(1)敲除p300能够导致KSHV早期裂解基因表达显着地增加，并促进BCBL1细胞增殖相关的基因表达；(2)敲除p300会显着抑制KSHV裂解态的激活即立即早期基因RTA和晚期裂解基因K8的大量表达；(3)敲除p300后细胞内的KSHV基因组拷贝数和病毒粒子的产量相应地减少；(4)p300基因的敲除抑制了KSHV感染的BCBL1细胞的生长。这些研究结果表明p300通过抑制卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)再激活来促进B淋巴瘤细胞增殖。　　目的：　　1.了解p300对KSHV感染的BCBL1增殖过程的影响以及KSHV基因表达的调控；　　2.探讨p300对BCBL1细胞中KSHV复制的影响；　　3.研究p300调控BCBL1细胞增殖的功能。　　方法：　　1.构建稳定敲除p300基因的细胞系　　a)建立稳定敲除p300基因的BCBL1细胞系　　本课题我们将用lentiCRISPRv2慢病毒敲除系统，设计含有靶向基因p300的sgRNA，利用慢病毒包装系统转染到293T细胞中，然后收集慢病毒感染BCBL1细胞，最后使用嘌呤霉素(puromycin)筛选成稳定的细胞系。　　b)鉴定p300基因敲除稳定细胞系　　利用Westernblot方法检测了BCBL1-sgRNA细胞系中p300的表达。同时用qPCR技术检测相应的mRNA表达水平，以确认细胞系中p300基因的敲除。　　2.用RNA-seq技术对稳定敲除p300的细胞系进行分析　　使用BCBL1-sgctrl和BCBL1-sgp300细胞，对提取的RNA进行高通量测序。　　3.检测p300被敲除后，探索对KSHV裂解复制的影响　　用TPA/SB诱导剂处理BCBL1-sgctrl和BCBL1-sgp300细胞5天，分别收取不同时间点的细胞和上清，提取细胞内和上清中病毒DNA，并用RT-qPCR检测KSHV基因组拷贝数的变化，确认p300对KSHV病毒复制的影响　　4.检测p300对BCBL1细胞增殖的影响　　使用台盼蓝和CFSE试剂在不同的时间点对细胞数目和增殖情况检测。　　结果：　　1.成功构建了p300基因敲除的稳定细胞系并获得RNA-seq数据。结果显示敲除p300能够导致KSHV早期裂解基因表达显着地增加，并促进BCBL1细胞增殖相关的基因表达。　　2.研究发现敲除p300会显着抑制KSHV裂解态的激活即立即早期基因RTA和晚期裂解基因K8的大量表达；敲除p300后细胞内的KSHV基因组拷贝数和病毒粒子的产量相应地减少。　　3.证明了p300能够影响KSHV感染的BCBL1的细胞增殖。　　结论：本研究结果综合表明p300通过抑制卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)再激活来促进B淋巴瘤细胞增殖，这为进一步阐释KSHV感染引起的PEL致癌机制提供了依据。

目录

声明

缩略词

第一章 前言

1.1 KSHV概述

1.2 KSHV生命周期

1.3 KSHV的致瘤机制

1.4 p300的结构

1.5 p300的生物学功能

1.6 p300与肿瘤治疗

1.7 p300相关的DNA病毒研究

1.8 立体依据

1.9 研究意义

1.10 技术路线

第二章 稳定敲除p300的BCBL1细胞系的构建

1. 实验材料

1.1 质粒、菌种和细胞来源

1.2 实验试剂

1.3 实验仪器

1.4 主要溶液配制

2 实验方法

2.1 细胞培养

2.2 细胞传代

2.3 细胞复苏

2.4 细胞冻存

2.5 重组质粒的构建、转化与扩增

2.6 慢病毒的制备与稳定细胞系的筛选

2.7 Western blot

2.8 RNA的提取和相对荧光定量PCR

3 实验结果

3.1 重组质粒构建

3.2 稳定敲除p300的BCBL1细胞系筛选鉴定

3.3 稳定敲除p300后KSHV基因表达水平的检测

4. 小结

第三章 p300对宿主细胞和KSHV基因表达影响的研究

1 实验材料

1.1 细胞

1.2 实验试剂

1.3 实验仪器

1.4 主要试剂的配制

2 实验方法

2.1 RNA-Seq 转录组测序

2.2 细胞增殖和凋亡的检测

2.3 细胞内KSHV 基因组DNA和上清中病毒DNA的提取

2.4 标准曲线的建立

2.5 相对定量PCR和绝对定量PCR

3 实验结果

3.1 RNA-Seq转录组测序分析

3.2 KSHV感染的BCBL1细胞中的人类基因表达谱。

3.3 p300促进BCBL1细胞的增殖

3.4 KSHV感染的BCBL1细胞中的KSHV基因表达谱

3.5 p300对感染的BCBL1细胞中的KSHV裂解复制的影响

4 小结

第四章 全文总结与讨论

第五章 展望

参考文献

附录

在校期间发表论文及科研成果

致谢