酵母6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶结构和生化性质的研究

摘要

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)是戊糖磷酸途径(Pentose PhosphatePathway)氧化阶段的第三个酶。戊糖磷酸途径的生物学意义土要有两个方而： 1.是细胞产生还原力NADPH的主要途径，NADPH在还原性生物合成中起负氢离子供体的作用。提供的还原力主要用于保护细胞免受氧化胁迫的危害，合成脂肪酸固醇类物质，以及保证脊椎动物的红细胞中谷胱甘肽处于还原态。2.足细胞内不同结构糖分子的重要来源，并为各种单糖的互相转变提供条件。最近，磷酸戊糖途径又被发现在肿瘤增殖过程扮演着重要的角色，人们对这个经典途径又有了新的认识和兴趣。6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶催化的反应是将6-磷酸葡萄糖酸脱羧氧化成5-磷酸核酮糖，产生二氧化碳并将NADP还原成NADPH。我们研究的是酿酒酵母中的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶Gnd1。Gnd1的晶体用X射线衍射方法的到的数据分辨率达2.37A。Gnd1是二聚分子，每个单体结构可分成三个结构域。1到127号残基构成典型的

目录

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致谢

摘要

第一章综述——6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶

第一节自由基理论[1-3]

1.1自由基

1.2自由基对生命大分子物质的损害

第二节酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中氧化应激反应

2.1非酶系的防御系统

2.2酶系防御系统

第三节氧化应激与一些疾病的关系

3.1氧化应激与阿尔海默病（Alzheimer disease,AD）

3.2氧化应激与癌症

第四节磷酸戊糖途径的反应

第五节磷酸戊糖途径的生理意义

5.15-磷酸核糖的生成

5.2NADPH+H+的作用

第六节6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶

6.1不同物种中6-磷酸葡糖酸脱氢酶的结构解析进展

6.26-磷酸葡糖酸脱氢酶的催化机制的研究

6.36-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的医学和生物学意义

第七节本论文研究内容、目的和意义

第二章实验结果和讨论

第一节Gnd1的克隆、表达、纯化及基本生化性质的鉴定

1.GND1基因的克隆与表达质粒的构建

2.Gnd1的表达及纯化

第二节Gnd1的初步晶体学研究

1.Gnd1的晶体成长及Gnd1晶体衍射数据的收集

2.Gnd1晶体衍射数据的分析

第三节Gnd1的总体结构

1.总体结构

2.柠檬酸分子的结合

第四节Gnd1及突变体酶学活性研究

1.测定酶促反应的米氏常数Km及最大速度Vm

2.突变体酶学活性研究

3.柠檬酸抑制性质的研究

第三章实验材料和方法

第一节基因的克隆及表达质粒构建

1.基因克隆

2.感受态细胞的制备

3.感受态细胞的转化

4.质粒PCR和双酶切验证

5.DNA序列的测定

第二节Gnd1的表达和纯化

1.Gnd1的表达

2.Gnd1的纯化、脱盐和浓缩

第三节Gnd1晶体生长和衍射数据收集

1.晶体生长

2.X射线衍射数据收集和处理(此部分工作主要由王伊同学完成)

第四节Gnd1酶学活性和酶学动力学的初步研究

1.测定酶活性

2.测定酶促反应的米氏常数Km及最大速度Vmax

3.柠檬酸抑制常数Ki的测定

第五节去C端突变蛋白的克隆，表达和纯化

第六节Gnd1△C53晶体初筛及优化

小结

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文