BMP4/Smad1信号通路在糖尿病肾病系膜基质增生中的作用研究

摘要

目的：糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)为糖尿病(diabetes mellitus，DM)的常见并发症之一，可导致终末期肾病及一系列心血管并发症。DN发病机制复杂，其基本病理改变为系膜基质增生及基底膜增厚。骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein4，BMP4)属于转化生长因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成员之一，参与调节细胞的形态分化、增殖、迁徙、凋亡等，在神经系统、心血管系统、泌尿系统的生理及病理过程中都具有重要作用。BMP4能够通过Smad及非Smad信号通路调控目的基因的转录。最近研究发现BMP4/Smad1信号通路可能与糖尿病肾病发病密切相关，尤其在参与系膜基质增生方面。本实验将对BMP4/Smad1信号通路在糖尿病肾病系膜基质增生中的作用进行相关研究。　　方法：1、动物实验：40只SPF级健康雄性SD大鼠随机分为对照组（CON组，18只）、糖尿病肾病组（DN组，22只），DN组予以高脂饲料喂养4周后，予单次腹腔注射1％链脲佐菌素(STZ)溶液35mg/kg诱导糖尿病，CON组注射同等体积的0.1mmol/L柠檬酸盐缓冲液。72小时后测血糖，连续3天血糖＞16.7mmol/L为糖尿病造模成功。2周后，24h尿蛋白定量＞30mg，尿量＞原尿量50％者为DN模型制备成功。分别于各时间点收集各组大鼠血清及尿液进行相关指标检测，收集大鼠肾脏组织进行HE染色，PASM染色，观察肾小球的基本病理改变情况;免疫组化染色检测：BMP4、ALK3、Smad1、Col4、Col1、MMP9;2、细胞实验：将大鼠系膜细胞分组为低糖组(LG组：培养基含5.6mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG组：培养基含30mmol/L葡萄糖)、等渗透压对照组（OP组：培养基含5.6mmol/L葡萄糖+24.4mmol/L甘露醇），分别培养24h、48h、72h，运用免疫荧光检测BMP4、Smad1、Col4表达，根据上述结果选择最佳时间点，并于最佳时间点运用CCK-8法检测系膜细胞增殖;将大鼠系膜细胞分组为低糖组(LG组)、高糖组（HG组）、高糖+BMP4-siRNA组（BMP4-siRNA组）、高糖+scramble-siRNA组（scramble-siRNA组），培养至最佳时间点，运用western bolt检测BMP4、ALK3、Smad1、Col4、Col1、MMP9的表达;NOGGIN重组蛋白为BMP4拮抗剂，为进一步验证BMP4/Smad1在糖尿病肾病系膜基质增生中的作用，将大鼠系膜细胞分组为低糖组(LG组)、高糖组(HG组)、高糖+NOGGIN组(NOGGIN组)、高糖+BSA组（BSA组），培养至最佳时间点，运用western bolt检测ALK3、Smad1、Col4、Col1、MMP9的表达。　　结果：1、动物实验：1）一般资料：SD雄性大鼠的一般情况：DN组雄性大鼠在注射STZ后逐渐出现饮水增多、食量增多、尿量增多。第8周出现活动量减少、反应稍迟钝、体重下降，皮毛光泽度下降;第12周出现进一步消瘦，部分大鼠出现腹部膨隆、尾部溃烂、颌下包块等症状，到16周时各种症状均加剧。CON组大鼠无明显饮水增多、食量增多、尿量增多，反应敏捷，活动量较多，体质量逐渐增加。体重：DN组大鼠体重随时间逐渐减轻，CON组大鼠体重逐渐增加。DN组大鼠体重与同时间点CON组相比明显减轻(P＜0.05)。血糖：与CON组相比，DN组大鼠各时间点血糖值均显著增高(P＜0.05)。24小时尿蛋白定量(24-h Upro)：DN组大鼠24-h Upro各时间点均较CON组升高(P＜0.05)，且随时间延长逐渐升高。肾功能：血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)和胱抑素C(CysC)：DN组大鼠8周、12周、16周时BUN水平、胱抑素C水平均较同期CON组显著增高(P＜0.05);第8周时DN组大鼠Scr值与CON组相比无明显差异，12周及16周时DN组Scr较CON组显著升高(P＜0.05)。2）肾组织：HE染色：CON组大鼠各时间点肾小球大小正常，形态正常，基底膜未见增厚，系膜基质未见增生。DN组大鼠于8周末时可见肾小球体积轻度增大，基底膜轻度增厚，系膜区增宽;12周末时可见基底膜增厚及系膜基质增生较笫8周更为明显，16周末时肾组织病变加重，基底膜重度增厚，并可见节段性硬化。PASM染色：CON组大鼠各时间点未见明显异常，各时间点可见系膜区少许黑色胶原的沉积，基底膜也无增厚;DN组于第8周末与同时间点CON组相比可见系膜区黑色胶原的沉积明显增多，同时伴有基底膜增厚(P＜0.05);12周末可见系膜基质增生及基底膜增厚更加明显(P＜0.05);于第16周末可见DN组大鼠肾脏系膜基质明显增生，曾弥漫样或结节样分布，基底膜进一步增厚(P＜0.05)。3)免疫组化染色：CON组肾组织各时间点可见少量散在BMP4、ALK3、Smad1、Col4、Col1蛋白的表达，并随时间延长无明显改变;DN组肾组织各个时间BMP4、ALK3、Smad1、Col4、Col1的蛋白表达较同期CON组明显增多，并随时间延长逐渐增多(P＜0.05);而CON组各个时期MMP9无明显变化，DN组大鼠8周时MMP9的表达较同期CON组无明显变化，第12周及第16周MMP9表达水平较DN组减少(P＜0.05)。2、细胞实验：1）大鼠系膜细胞免疫荧光染色：LG组及OP组大鼠系膜细胞绿色荧光表达较弱，且随时间的改变无明显变化。HG组各时间点BMP4、Smad1、Col4的表达均较LG组及OP组增强;于48h开始较LG组及OP组明显增强。据上述结果将48小时作为最佳时间点进行后续实验。CCK8法检测细胞增殖：HG组于48小时的增殖水平较LG组及OP组相比有所增加，但无明显统计学意义(P＜0.05)。2）通过预实验已经筛选出最佳转染条件，通过westerm blot检测各组的相关蛋白表达情况。与LG组相比，HG组BMP4、ALK3、Smad1、Col4、Col1表达明显增多(P＜0.05)，而MMP9的表达减少(P＜0.05)。BMP4-siRNA组与HG组相比BMP4、ALK3、Smad1、Col4、Col1表达明显减少(P＜0.05)，MMP9的表达增多(P＜0.05);3)预实验已经筛选出最佳的NOGGIN蛋白浓度，通过westerm blot检测各组的相关蛋白表达情况，与LG组相比，HG组ALK3、Smad1、Col4、Col1表达明显增多（P＜0.05），MMP9的表达减少(P＜0.05)，而NOGGIN组与HG组相比ALK3、Smad1、Col4、Col1表达减少（P＜0.05），MMP9的表达增多(P＜0.05)。　　结论：1.糖尿病肾病系膜基质增生时存在BMP4/Smad1信号通路的激活;2.阻断BMP4/Smad1信号通路可明显减少糖尿病肾病系膜基质增生。

目录

摘要

前言

材料与方法

1．实验材料与仪器

2．实验方法

3．统计分析

结果

1．动物实验

2．细胞部分

讨论

1．糖尿病肾病的病理改变及研究现状

2．BMP4／Smad1信号通路激活与糖尿病系膜基质增生

3．阻断BMP4／Smad1信号通路减少糖尿病肾病系膜基质增生

结论

参考文献

英文缩略词表

致谢

BMP4／Smad1信号通路与糖尿病肾病系膜基质增生研究进展 综述

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