水杨酸调节AMPK/TSC2/mTOR信号通路增加宫颈癌细胞的放射敏感性研究

摘要

目的:一磷酸腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是调节细胞能量代谢中的一个关键调控因子。辐射代谢组学研究显示，活化的AMPKαThr172是增加肿瘤细胞放射敏感性的一个潜在靶标，已在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞得到证实。新近有研究证实，水杨酸(Salicylic acid，SA)可直接活化AMPK。本文旨在研究SA放射治疗是否增加对宫颈癌细胞的辐射增敏作用，以及其潜在的分子机制。　　方法:结晶紫法检测水杨酸对人宫颈癌HeLa/Ca Ski细胞的生长抑制作用;γH2AX-Foci分析法检测放射诱导的宫颈癌细胞DNA损伤;克隆分析法检测水杨酸对宫颈癌细胞的剂量存活分数和放射生物学参数;蛋白质印迹(Western Blot)检测AMPK、TSC2和mTOR的表达和活化;流式细胞术检测宫颈癌细胞周期及细胞凋亡分布。　　结果:SA呈剂量（0.5-10mmol/L）和时间(24-72hr)依赖性地抑制宫颈癌Ca Ski、HeLa细胞的生长;SA增加了X-ray8Gy照射后宫颈癌Ca Ski细胞DNA损伤的γH2AXfoci形成，并使DNA修复延迟;细胞克隆分析显示，SA显著(P＜0.05)降低了照射后宫颈癌Ca Ski细胞的克隆形成和存活分数，相关放射生物学相关参数:SF2值为46.06％、平均致死剂量D0值为1.64Gy、准域剂量Dq值为0.439Gy、辐射增敏比SER值为1.93;单纯SA作用48小时后Ca Ski细胞凋亡比率升高(17.32％ VS8.52％，P=0.012)，并增加了放射诱导的细胞凋亡(20.59％ VS13.39％，P=0.001);单纯SA作用24小时后Ca Ski细胞各周期分布与对照组相比并未明显改变(P＞0.05)，但SA促进辐射后细胞周期阻滞由G2/M期(25.38％ VS13.05％)向G1期阻滞转变(47.35％ VS76.29％)，P值均小于0.05;Western Blot分析显示，辐射促进p-AMPKαThr172升高，并呈现剂量（0-6Gy）依赖性;SA可诱导Ca-ski细胞AMPKαThr172和TSC2Ser1387磷酸化水平升高;并显著下调放射诱导的p-mTOR Ser2448表达(P=0.000)。　　结论:SA可通过调节AMPK/TSC2/mTOR信号通路增加宫颈癌Ca Ski细胞对辐照的敏感性。靶向AMPK/TSC2/mTOR信号通路可能为改善临床宫颈癌放射治疗效果提供了一个新的方向。

目录

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2．细胞培养

3 结晶紫方法检测细胞的存活率

4 平板克隆实验

5 免疫荧光检测γH2AX foci

6 细胞周期和凋亡检测(Annexin V)

7 Western blotting检测蛋白表达

8 统计分析

结果

1 水杨酸(SA)对Ca Ski、HeLa细胞增殖的影响

2．蛋白免疫印迹实验观察水杨酸作用时间与AMPK活性表达的关系

3．细胞克隆形成率及百分存活率

4 γH2AX-Foci分析法检测放射诱导的宫颈癌细胞DNA损伤

5 细胞周期实验研究水杨酸对Ca Ski细胞辐射增敏作用

6 细胞凋亡实验研究水杨酸对Ca Ski细胞辐射增敏作用

7 WB检测水杨酸与辐射对AMPK／TSC2／mTOR通路的影响

讨论

结论

参考文献

英文缩略词对照表

致谢

综述 AMPK在肿瘤放射治疗中的作用

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