蝎毒BmBKTx1结构与功能的研究前体蛋白加工酶furin的研究

摘要

本论文主要涉及三个方面的工作。第一部分：蝎毒BmBKTx1双功能面的研究；第二部分：前体蛋白加工酶furin在胞内定位的研究：第三部分：基于组蛋白H1.2片段的furin抑制剂的研究。 1.蝎毒BmBKTx1双功能面的研究 在漫长的3.5亿年的生存选择中，蝎子逐渐进化出了形形色色，功能各异的神经活性多肽，这些多肽是它们进攻与防御的主要武器，大多作用于各类Na+和K+通道。钾离子通道是生物体中最基础的功能蛋白之一，对钾离子有高度离子选择通透性，在生理的变化过程中起着重要的作用。目前，蝎活性多肽已经成为研究K+通道的药理，生理，结构和功能特性的最有力的工具。BmBKTx1是从东亚马氏钳蝎中纯化到的一个新型短链毒素。它由31个氨基酸残基组成，含3对二硫键，与SK(低电导钙激活型钾通道)毒素的一级结构比较相似，但仅仅具有比较弱的SK阻断活性。实验表明BmBKTx1对高电导钙激活型钾通道(BK)有明显的抑制作用，同时它不具有对电压门控型钾通道(Kv)的抑制活力。BmBKTx1是第一个报道的能同时作用于BK和SK的蝎毒素，它具有一定的昆虫选择性，也是第一个能作用于果蝇BK通道(dSlo)的蝎毒素。 BmBKTx1是第一个被确认的能够同时作用于BK通道和SK通道的蝎毒素。它有可能是通过两个不同的功能面来作用于这两个通道。为了证明这个假设，本文在大肠杆菌中重组表达了BmBKTx1的野生型和它的两个突变体，K21A-Y30A和R9A-K11A，并测定了它们对蟑螂的BK通道(pSlo)和大鼠的SK2通道的阻断活性。结果表明突变体K21A-Y30A对BK通道的阻断活性有着明显的降低，但是对SK通道的阻断活性没有变化。而突变体R9A-K11A对BK通道和SK通道的阻断活性均没有变化。这些结果证实了BmBKTx1具有双功能面的假设，并且确认了它的BK功能面位于毒素C端的β折叠上。这些结果可以促进BmBKTx1在BK通道疾病的治疗，搜寻钾通道毒素，以及杀虫剂等方面的应用开发。 2. Mint3与furin相互作用调控了furin在高尔基体上的定位 多肽或蛋白质以前体形式合成后，需要前体蛋白加工酶的剪切才能获得完全的生物活性。这些前体蛋白加工酶成为生物体内重要的生理病理过程的调控者。Furin是发现得最早且功能研究最为清楚的哺乳动物前体加工酶，许多重要的生理过程需要furin的参与，如多肽与蛋白质激素的合成与分泌、膜受体的成熟、血浆蛋白前体的激活等；同时多种疾病的发生也与furin密切相关，如病毒外壳蛋白和细菌外毒素的加工活化以及肿瘤的转移等。现阶段虽然对furin的细胞内定位和自身加工成熟有较多研究，但很多具体机制和细节并不清楚。因此，对furin相互作用蛋白质的鉴定和功能分析不仅具有重要的理论意义，也有利于开发抗病毒和抗细菌外毒素的先导药物。 前体加工酶furin在细胞内分泌后，在质膜，内吞体和高尔基体(TGN)之间循环，主要分布于高尔基体。Mint3是Mint接头蛋白家族的成员，可以调控膜蛋白的运输和分泌。迄今为止，对于在furin的运输和定位过程中，mint3所起的作用仍然了解得很少。本文通过免疫共沉淀和免疫荧光共定位的实验，证明了mint3和furin可以相互作用，并且它们在HeLa细胞里共定位于高尔基体。通过RNA干扰的方法下调内源mint3的表达之后，furin的高尔基体定位被破坏，同时增加了其在内吞体中的分布。进一步的实验表明mint3通过PTB结构域(phosphotyrosine binding domain)与furin相结合，并调控了furin在高尔基体上的定位。此外，对furin进行突变发现，mint3主要通过和furin的酸性多肽信号区相互作用来调节furin的分布。我们的实验结果第一次发现，mint3通过PTB结构域与furin的酸性多肽信号区相互作用调控了furin在高尔基体上的特异性定位。这些结果阐明了一条新的furin在细胞内定位和转运的途径，提供了furin相关疾病的新的药物靶点，有利于治疗学方面的发展。 3.基于组蛋白H1.2片段的furin抑制剂的设计改造 在哺乳动物的许多生理和病理活动中，前体加工酶furin起到了非常重要的作用，例如对病毒糖蛋白和细菌毒素的激活。寻找小分子量，无毒性，高活力的furin抑制剂是解决该类疾病的非常有吸引力的药物设计途径。本文根据furin的抑制剂histone H1.2的C端片段设计和合成了一系列的短肽抑制剂。将抑制剂的活性位点替换成为furin的最佳底物识别位点，可以极大地增强抑制剂的抑制活性。在所设计的短肽抑制剂中，抑制活力最好的是一条14肽的抑制剂，对furin的抑制常数Ki达到17nM。尽管大多数合成的短肽都是可逆性的抑制剂，但是其中的一条9肽对furin有很高的稳定性，在37℃共保温3h后仍保留有全部的抑制活力。这些短肽抑制剂可以成为新的furin介导疾病的药物设计模板。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 蝎毒的分类和功能综述

1.1蝎钾离子通道毒素(KTx)

1.1.1钾离子通道

1.1.2 KTx的分类

1.1.3 KTx的结构与功能

1.1.4 KTx与钾离子通道的结合模式

1.1.5 KTx的功能对假说

1.1.6 KTx的进化

1.2蝎钠离子通道毒素

1.2.1钠离子通道

1.2.2钠离子通道毒素的分类

1.2.3 α类毒素的分类

1.2.4 β类毒素的分类

1.2.5钠离子通道毒素的结构

1.3蝎氯离子通道毒素和钙离子通道毒素

1.4结语

参考文献

第二章 蝎毒BmBKTx1双功能面的研究

2.1前言

2.2材料和方法

2.2.1材料和仪器

2.2.2表达和纯化

2.2.3重组毒素二硫键配对确认

2.2.4圆二色谱测定

2.2.5重组毒素活性测定

2.3结果

2.3.1 BmBKTx1的突变体的设计

2.3.2重组毒素的表达和纯化

2.3.3重组毒素二硫键配对确认

2.3.4圆二色谱测定

2.3.5重组毒素活性测定

2.4讨论

2.4.1 BmBKTx1和BK通道的相互作用

2.4.2 BmBKTx1和SK通道的相互作用

2.4.3 BmBKTx1的BK通道和SK通道的双阻断功能面

2.4.4 BmBKTx1在HIV治疗上的应用前景

2.4.5 BmBKTx1的独一性

2.5总结

2.6致谢

参考文献

第三章 前体蛋白加工酶furin的综述

3.1蛋白前体加工酶(proprotein convertase，PC)研究简述

3.1.1蛋白前体加工酶的发现

3.1.2蛋白前体加工酶的分类和组织分布

3.2哺乳动物前体加工酶的结构

3.2.1一级结构

3.2.2晶体结构

3.3前体加工酶的翻译后加工与细胞内分拣定位

3.3.1细胞分泌机制

3.3.2 Furin的成熟与双循环机制

3.4 Furin的生物学功能

3.5 Furin抑制剂的研究

3.5.1小分子抑制剂

3.5.2蛋白质大分子抑制剂

3.6总结

参考文献

第四章 Mint3与furin的相互作用调控了furin的高尔基体定位

4.1前言

4.2材料和方法

4.2.1材料

4.2.2细胞培养及转染

4.2.3免疫共沉淀和蛋白质印迹

4.2.4免疫荧光检测

4.2.5细胞膜表面furin荧光活性的检测

4.2.6 Furin基因的获得及其CA、P、CY结构域和各突变体的表达

4.2.7 GST-pull down

4.2.8人Mint3基因的克隆及各结构域的克隆表达

4.2.9鼠Mint3基因的克隆及GFP/PTB、GFP/△PTB融合蛋白的克隆

4.2.10 His-tag pull down

4.2.11 Mint3 RNAi质粒的构建

4.3结果

4.3.1 Furin与Mint3存在相互作用

4.3.2 Mint3调控了furin在高尔基体上的定位

4.3.3 Mint3通过其PTB结构域与furin相互作用

4.3.4 Mint3主要与furin细胞质结构域的酸性多肽信号区结合

4.4讨论

4.5致谢

参考文献

第五章 基于histone H1.2的furin抑制剂的设计改造

5.1前言

5.2材料和方法

5.2.1材料

5.2.2短肽抑制剂的合成

5.2.3短肽抑制剂的纯化

5.2.4短肽抑制剂的K值测定和稳定性测定

5.2.5 HPLC分析短肽抑制剂的稳定性

5.3结果

5.3.1抑制剂对furin的抑制活力

5.3.2抑制剂的最优化设计

5.3.3抑制剂的稳定性测定

5.3.4 HPLC分析短肽抑制剂的稳定性

5.4讨论

5.5致谢

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的研究成果