前体蛋白加工酶PACE4在前列腺癌中的表达及功能研究

摘要

目的:探讨前体蛋白加工酶PACE4在前列腺增生(Benign prostatichyperplasia，BPH)、前列腺上皮内瘤变(Prostate intraepithelial neoplasia，PIN)及前列腺癌(Prostate cancer, PCa)组织中的表达及其与前列腺癌临床分期、血清PSA水平、Gleason评分之间的关系;在细胞水平验证PACE4的表达与细胞增殖能力和侵袭能力的关系，预测分析PACE4的干扰miRNA，验证miR-124对前列腺癌细胞系DU145中PACE4表达调节以及细胞增值、迁徙和侵袭特性的影响，为前列腺癌的诊断、监测以及随诊提供新的可供参考的标志物，为前列腺癌的治疗提供新的靶点。
　　方法:应用免疫组化SP法检测PACE4在72例前列腺癌、10例前列腺上皮内瘤变和40例良性前列腺增生症组织中的表达，并与前列腺癌临床分期、血清PSA水平及Gleason评分之间的关系进行统计学分析;培养前列腺癌细胞系DU-145、PC-3、LNCaP、C42和前列腺增生细胞株BPH-1，细胞计数、软琼脂克隆实验和侵袭实验验证细胞株的增殖能力和侵袭能力，应用Realtime PCR、Westernblot检测各细胞株中PACE4及相关信号分子的表达状况，应用免疫荧光染色显示各细胞中PACE4的表达。预测分析PACE4的干扰miRNA，检测PACE4高表达、低表达和不表达的DU-145、C42和BPH-1中所预测miRNA的表达，根据上述实验结果，通过与信息库比对预测miR-124直接靶向PACE4-3'UTR，利用双荧光素酶报告系统实验确定目标miRNAs，构建pMIR-Report-PACE43'UTR报告质粒和pMIR-Report-mut-PACE43'UTR报告质粒，转染293T细胞和荧光素酶报告分析系统分析结果。设计、合成miR-124的oligo片段和inhibitor片段，脂质体LipofectamineTM RNAiMAX将其转染进入DU-145、C42和BPH-1细胞内，Realtime PCR和Westernbloting检测细胞内PACE4 mRNA和蛋白水平的表达。利用流式细胞仪检测DU145细胞转染miR-124以后的细胞周期变化，分析细胞增殖能力;利用Martrix胶侵袭实验检测细胞侵袭能力变化。采用免疫细胞染色检测转染miR-124后，DU-145细胞表达MUC1的变化，并将实验结果进行分析。
　　结果:(1)PACE4在PCa、PIN及BPH中的阳性率分别为92％、80％及20％，PCa和BPH两组中的阳性表达差异有统计学意义(P＜0.05)，而在PCa和PIN中的阳性表达无明显差异(P＞0.05)。PACE4在前列腺癌中的表达与患者临床分期、血清PSA水平、肿瘤分级(Gleason评分)密切相关（P＜0.05）。PACE4阳性率与肿瘤临床分期呈正相关(P＜0.01)，Ⅰ期和Ⅲ期、Ⅳ期之间差异有统计学意义(P＜0.05);与Gleason评分呈正相关(P＜0.01)，随肿瘤Gleason评分的增高PACE4阳性率呈上升趋势。术前PSA水平＜10 ng/ml和＞20 ng/ml两组组间差异有统计学意义(P＜0.05)。PACE4在有无骨转移两组间差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　(2)培养前列腺癌细胞株DU-145、PC3、LNCaP、C42及前列腺增生细胞株BPH-1，其中DU-145细胞的增殖能力和侵袭能力最强，C42在PCa细胞株中增殖能力和侵袭能力最弱。利用Realtime PCR和Western blot检测细胞中PACE4及相关信号分子的表达，发现PACE4在DU-145中表达最高，前列腺癌细胞株中C42较少，所有细胞株中BPH-1最少，同时其关信号分子基因水平IGFBP3和THBS1低表达及Furin、Seprine2、MUC、CDK6高表达，蛋白水平P53、MUC1及PTEN高表达，细胞免疫荧光显示DU145细胞中PACE4的表达也最高，以上结果提示PACE4表达水平与前列腺癌恶性程度及侵犯转移密切相关。
　　(3)利用生物学软件预测分析PACE4的干扰miRNAs，根据预测结果选取mir-9-5p、mir-506-3p、hsa-mir-124-3p、mir-590-5p和mir-21-5p，选用明确的PACE4高表达、低表达和不表达的DU-145、C42和BPH-1通过Realtime PCR检测以上miRNAs的表达，发现miR-124、miR-21在DU-145中的表达明显低于在BPH-1中的表达，miR-124、miR-21在DU-145和BPH-1中表达存在明显差异(P＜0.05);双荧光素酶检测miRNA与PACE43'UTR的关系，并转染293T细胞，荧光素酶报告分析系统分析结果，过表达miR-124和miR-21后，报告系统的荧光值显著减少(P＜0.05)，提示miR-124、miR-21与PACE43'UTR存在靶向关系;将miR-124转染进入DU-145、C42和BPH-1细胞内，Realtime PCR和Western blot检测细胞内PACE4 mRNA和蛋白水平的表达，并检测细胞转染miR-124以后的细胞周期变化，分析细胞增殖能力及侵袭能力的变化。发现将miR-124转染DU-145细胞后，转染组细胞增殖、迁移和侵袭能力减低，细胞周期阻滞，而转染了miR-124 inhibitor片段C42细胞和BPH-1细胞的细胞增殖、迁移和侵袭能力升高，细胞表达MUC1水平也同时升高，而转染miR-124后DU145细胞表达MUC-1显著减少。提示miRNA可通过抑制PACE的表达使细胞的增殖和迁移能力下降，细胞的恶性都减少。
　　结论:前列腺癌组织中PACE4高表达，并与前列腺癌的临床分期、血清PSA水平及Gleason评分有密切相关，提示PACE4可作为前列腺癌的一个有价值的诊断指标。预测分析PACE4的干扰miRNA，miR-124可直接靶向PACE4-3'UTR，将miR-124转染DU-145后细胞增殖、迁移和侵袭能力减低，细胞周期阻滞，提示miR-124可通过抑制PACE4的转录来抑制前列腺癌的增值和转移。

目录

声明

摘要

缩略语／符号说明

前言

研究现状、成果

研究目的、方法

一、前体蛋白加工酶PACE4在前列腺癌组织中的表达

1．1 对象和方法

1．1．1 组织标本来源

1．1．2 实验试剂

1．1．3 主要仪器设备

1．1．4 实验溶液的配制

1．1．5 组织切片制备

1．1．6 实验步骤

1．1．7 实验分组

1．1．8 统计学分析

1．2 结果

1．2．1 PACE4在前列腺癌、高级别前列腺上皮内瘤变、良性前列腺增生组织中的表达

1．2．2 PACE4在前列腺癌的表达与临床病理特征之间的关系

1．2．3 PACE4在前列腺癌的表达与患者生存期之间的关系

1．3 讨论

1．4 小结

二、前列腺癌细胞中PACE4以及相关信号因子的表达

2．1 对象和方法

2．1．1 实验对象

2．1．2 实验方法

2．2 结果

2．2．1 各类前列腺癌细胞株复苏后培养结果

2．2．2 绘制细胞的生长曲线

2．2．3 比较各类细胞株的增殖能力

2．2．4 比较各类细胞株的侵袭能力

2．2．5 各类细胞株内PACE4及相关信号分子的表达

2．3 讨论

2．3．1 前列腺肿瘤相关信号分子的研究

2．3．2 前列腺癌细胞中PACE4以及相关信号因子的表达

2．4 小结

三、PACE4干扰miRNAs的预测及通过PACE4途径miR-124对前列腺癌细胞的影响

3．1 对象和方法

3．1．1 实验对象

3．1．2 实验方法

3．2 结果

3．2．1 预测分析PACE4的干扰miRNA

3．2．2 Realtime PCR检测各类细胞内所预测miRNAs的表达

3．2．3 双荧光素酶检测miRNA与PACE4 3’UTR的关系

3．2．4 miR-124对肿瘤细胞PACE4表达调节以及细胞特性的影响

3．2．5 免疫细胞染色检测转染miRNA后，细胞表达MUC1的变化

3．3 讨论

3．3．1 PACE4干扰miRNA的预测及其在前列腺癌细胞内的表达

3．3．2 双萤光素酶报告基因系统的构建及应用

3．3．3 miR-124对前列腺癌细胞PACE4表达调节以及细胞侵袭特性的影响

3．4 小结

全文结论

论文创新点

参考文献

发表论文和参加科研情况说明

综述 PCs研究进展及PACE4与前列腺癌的关系

致谢