基于肠道菌群和肠肝轴相关性的决明子“清肝”作用机制研究

摘要

肠道菌群是一个庞大的复杂的微生态系统，对宿主健康起到非常重要的作用。近年来，许多研究表明，肠道菌群在各种疾病发生发展的过程中都扮演着重要的角色;而且越来越多的证据表明，肠道菌群在中药治疗各种疾病的过程中起着至关重要的作用，被誉为“打开中医药宝库的钥匙”。中药中含有丰富的化学成分，在体内吸收、分布、代谢、排泄的过程不可避免地与肠道菌群发生相互作用，肠道菌群可以影响中药成分的代谢和吸收，中药成分可以调节肠道菌群的组成结构及代谢，因而发挥各种各样的作用。不同的疾病发生发展过程中也往往伴随着肠道菌群失调，或是肠道菌群代谢异常等情况。因此，中药与肠道菌群的相互作用，可能是中药治疗疾病的相关机制之一。　　中药决明子(Cassiae Semen)是豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或小决明子CassialoraL.的干燥成熟种子，始载于《神农本草经》，具有清肝明目，润肠通便的传统功效。决明子在我国有2000多年的用药历史，作为药食两用品种，主要用于保肝、缓解便秘、降脂等。目前对于决明子传统功效润肠通便的研究较多，作用机制也相对清楚;且许多药理研究证明，决明子具有较好的“清肝”、保肝作用，但臼前对其作J刊机制的研究尚不充分。为了更好的了解决明子传统功效“消肝”、保肝作用的机制，本文在决明子的保肝作用研究基础上，从肠道菌群介导决明子保肝作用机制角度进行研究，为决明子治疗肝脏疾病的作用机制提供参考。　　本论文主要包括以下儿个部分：　　一、文献综述。通过检索中国知网、万方、维普、Pubmed、Web of Sciense等常用文献数据库，并查阅相关书籍，对决明子保肝作用研究现状以及肠道菌群在中药研究中的心用进行丫概述和总结。决明子提取物或活性成分保肝作用的机制主要包括①降低血脂，调节脂质代谢;②改善脂质过氧化;③缓解炎症反应;④调节肠道菌群，改善肠壁屏障，基于肠肝轴发挥作用;⑤免疫调节;⑥可能与通便作用相关。除关于决明子的降脂及抗氧化作用的机制研究相对清楚外，其余叫种可能的保肝作用机制研究尚不充分，还需要更多的实验来补充。关于肠道菌群在中药研究中的应用方面，本论文对肠道菌群的基本情况(包括分类和生理功能，常见代谢产物)、肠道菌群对中药成分的代谢、中药对肠道荫群的调节作用以及中药基于肠道菌群发挥作用的相关机制进行了概述和总结。目前已经鉴定出来的人肠道菌群主要是以厚壁菌门和拟杆菌门这两个优势菌门为主的共9个菌门组成的，根据其对宿主健康的影响可以分为生理性细菌、条件致病菌和过路菌(多为病原菌)。肠道菌群的主要代谢产物包括胆汁酸、短链脂肪酸、三甲胺及其氧化物以及脂多糖等，它们在肠道中对维持宿主健康方面发挥着不同的作用。此外，肠道菌群含有丰富的酶系，可以对中药中含有的成分进行脱糖基代谢等，以“水解为主，氧化还原为辅”的途径对中药成分进行代谢。中药中含有的各种成分也可以通过改变肠道菌群的生长条件或营养条件等方式调节肠道菌群的组成，并影响肠道菌群的代谢。中药与肠道菌群之间的这些相互作用，可以部分阐释中药治疗许多疾病的机制。许多疾病都伴随着肠道莴群失调或代谢产物的改变，如胃肠道疾病(溃疡性结肠炎、消化道肿瘤、肠应激综合征等)、肝脏疾病(非酒精性脂肪肝、肝硬化、肝癌等)、代谢性疾病(糖尿病，肥胖等)、神经系统疾病(抑郁症、帕金森病、阿尔茨海默症等)、心血管疾病(冠心病等)等，中药在治疗这些疾病时，常常可以通过调节肠道菌群组成以及代谢缓解疾病的症状。但目前的研究大多停留在中药调节疾病相关肠道菌群的层面，机体的调节机制、参与调节的相关靶点通路、肠道菌群发挥的具体作用研究较少。　　二、决明子的保肝作用研究。通过高脂饲料喂养(High Fat Diet-fed，HFD-fed)建立非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)小鼠模型，分别给予决明子醇提物(the extractofCassiae Semen，JMZ)、决明子总苷元提取物(the extract oftotal aglycone of Cassiae Semen，TA)，决明子中主要的2个活性单体成分——红镰霉素-6-β-龙胆糖苷(rubrofusarin-6-β-gentiobioside，RG)及橙黄决明素(aurantio-obtusin，AO)，观察其对NAFLD小鼠脂质秋累、肝损伤及肝脏炎症、肠道菌群失调、肠壁屏障损伤的影响。　　结果显示：①JMZ和TA均可以降低模型小鼠的肝重指数、血清胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)、游离脂肪酸(fleefatty acids，FFA)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-c);RG平AO可以降低TC和LDL-c，对TG和FFA改变不明显;②JMZ和TA都能降低NAFLD小鼠血清的丙氨酸氨基转氨酶(alaninc aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)，但两个单体成分只能降低血清ALT，对AST作用不明显;③四种药物均可以显著降低模型小鼠肝匀浆中的肿瘤坏死因予(tumour necrosis factor-alpha，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)，升高抗炎因子白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10);④相对于空白组，模型组的菌群多样性下降，给药后增加了模型组小鼠的菌群多样性，升高了厚壁菌门和拟杆菌门细菌的相对丰度，降低了变形菌门细菌的相对丰度;⑤模型组小鼠分别给予JMZ，TA，RG，AO后，小鼠回肠组织中Occludin、ZO-1m RNA的相对表达量明显升高，Occludin、ZO-1蛋白的表达情况给药后稍有上升，但不明显。上述结果表明决明子提取物或单体成分都能够在不同程度上改善NAFLD小鼠的脂质代谢紊乱、肝损伤、肝脏炎症、肠道菌群失调、肠壁屏障损伤。　　三、粪便微生物移植对决明子保肝作用的转移。为了验证决明予的保肝作用是通过肠道菌群发挥作用，我们设计了粪便微生物移植实验，具体是分别提取空白组、模型组、JMZ给药组、RG给药组小鼠的粪便微生物，及时移植到HFD-fed小鼠体内，观察被移植后的各组小鼠各项检测指标的变化情况。　　结果发现接受了空白组、JMZ组、RG组小鼠粪便移植的HFD-fed小鼠的脂质积累、肝损伤及肝脏炎症、菌群紊乱、肠壁屏障损伤状况都有一定的改善。分析其原因可能是空白组的正常菌群结构，及经给药后改善的给药组小鼠肠道菌群结构，通过粪便微生物移植，改变了受体HFD-fed小鼠的菌群结构并因此发挥了作用，似实验暂时无法排除粪便。综上，能含有的药物原型成分或(和)其在粪便LM勺代谢产物是否发挥了作用。综上，实验可以初步证明JMZ和RG对NAFLD小鼠的治疗作用会随着粪菌移植而转移，其保肝作用部分依赖于肠道菌群。　　四、抗生素诱导的肠道菌群紊乱对决明子保肝作用的影响。为了进一步验证决明子的保肝作用是依赖于肠道菌群的，我们设计了给予抗生素诱导HFD-fed小鼠菌群紊乱后再给药的实验，观察抗生素诱导的菌群紊乱对JMZ的药效作用的影响。首先，HFD-fed小鼠在给药前先[]服使刷不同的抗生素致菌群紊乱，给约的同时自由饮用含抗生素的灭菌饮用水维持菌群紊乱状态。实验结果发现经过抗生素处理后HFD-fed小鼠的脂质积累、肝损伤及肝脏炎症、菌群紊乱、肠壁屏障损伤状况没有改善，有些指标反而还加重了。　　结果证明抗生素诱导的菌群紊乱可以削弱甚至消除决明子的作用，进一步证明了我们对于决明予的保肝作用依赖于肠道菌群才得以发挥的假设。　　五、决明子改变的关键菌群及其潜在功能预测。为了明确在JMZ治疗NAFLD过程中发挥作用的关键菌群，我们采用Metastats分析来确定HFD喂养和给予决明子后显著改变的菌群系统类型，并用PICRUSt算法探索了微生物群的潜在功能。　　结果显示，在模型组中富集的菌属主要是Proteobacteria下的10个菌属，分别为Alcaligenaceae科的Sutterella，Oxalobacteraceae科的Janthinobacterium以及Enterobacteriaceae科下的8个菌属，分别为Enterobacter，Erwinia，Escherichia，Klebsiella，Morganella，Salmonella，Serratia和Trabulsiella;这些菌属的丰度均在给药后被逆转，其中JMZ显著降低了E1winia，Klebsiella，Morganella，Trabulsiella的丰度。在模型组中丰度降低的菌属Dehalobacterium，Adlercreutzia，Odoribacter，Rikenella，Mucispirillum，Clostridium，Dorea，Lachnobacterium，Oscillospira和Ruminococcus，经过给药处理后丰度升高，特别是JMZ处理后的Dehalobacterium、Oscillospira和Ruminococcus。在模型组中富集的菌群与大多与疾病相关指标呈正相关(Occludin，ZO-1除外)，而给药后富集的菌群正好相反。在模型中丰度升高的菌属具有增加LPS、支链氨基酸和芳香族氨基酸等与内毒血症、炎症反应、肥胖和胰岛素抵抗相关的代谢物的潜在功能，给药组富集的菌属与模型组的这些菌属的作用相拈抗。另一方面，红给药组中丰度升高的菌属对脂质代谢，胆汁酸生成等方面有积极的影响，而存模型组中丰度升高的菌属对此起相反作用，并且给药后抑制了这些菌属的作用。　　总体来说，这些结果表明，决明子及其组分可以调节具有特定代谢功能的肠道微生物的丰度和组成，诱导产生有益于NAFLD的代谢物，减少有害的代谢物，从而改善NAFLD小鼠内毒素血症和脂质秋累，从而减少脂质毒性、细菌易位等因素引起的肠屏障损伤、肝损伤和炎症反应。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章决明子保肝作用研究现状及肠道菌群在中药研究中的应用

第一节决明子保肝作用研究现状

1调节脂质代谢

2改善脂质过氧化

3缓解炎症反应

4与肠肝轴相关的作用

5其他作用

6小结

第二节肠道菌群在中药研究中的应用

1肠道菌群的分类和生理功能

2肠道菌群代谢产物及其生物活性

3肠道菌群对中药成分的代谢

4中药对肠道菌群的调节作用

5中药基于肠道菌群发挥作用的相关机制

第二章决明子的保肝作用研究

1材料

2方法

3结果

4小结与讨论

第三章粪便微生物移植对决明子保肝作用的转移

1材料

2方法

3结果

4小结与讨论

第四章抗生素诱导的菌群紊乱对决明子保肝作用的影响

1材料

2方法

3结果

4小结与讨论

第五章与决明子保肝作用有关的关键菌群及其潜在功能预测

1方法

2结果

3小结与讨论

第六章结果与讨论

参考文献

致谢

简历

附录