非生物胁迫下毛竹qRT-PCR分析中内参基因的选择

摘要

毛竹（Phyllostachys edulis）隶属禾本科刚竹属，因其生长快速、材质优良以及用途广泛等特点，成为我国经济价值最大的竹种。然而，随着环境的日益恶化，冷害、干旱、土壤盐碱化等非生物胁迫严重影响了毛竹笋材产量及品质。因此，非生物胁迫研究对毛竹生产实践具有重要意义。实时荧光定量PCR是目前研究发育过程中基因时空表达规律的常用手段，而选择合适的内参基因是准确分析目标基因相对表达量的前提条件。但目前非生物胁迫下毛竹内参基因选择的研究尚未见研究报道。　　本研究以低温、干旱和盐胁迫条件下毛竹的根、茎、叶为实验材料，通过qRT-PCR技术对10种候选内参基因:TIP41、NTB、KDSA、PP2A、SAND、eIF-4α、18S rRNA、HSP、GAPDH和ACT在其不同器官和组织中的表达情况进行了详细分析。经GeNorm、NormFinder和BestKeeper3个分析软件对比分析发现:1、在低温处理下，比较不同叶片或不同组织之间的基因表达差异时，可选取eIF-4α和TIP41作为校正内参基因。2、在盐胁迫下，比较不同叶片之间的基因表达差异时，可选取eIF-4α作为校正内参基因;比较不同组织之间的基因表达差异时，可选取eIF-4α或TIP41作为校正内参基因。3、在干旱条件下，比较不同叶片之间的基因表达差异时，可选取NTB和KDSA作为校正内参基因;比较不同组织之间的基因表达差异时，可选取NTB和TIP41作为校正内参基因。上述发现与多数文献把ACT作为毛竹唯一内参基因的研究不一致。本研究为在非生物胁迫下毛竹qRT-PCR分析中选择合适的内参基因提供了理论依据。　　另外，为探索毛竹中的内参基因是否适用于其他竹种，本研究还以紫竹（Phyllostachys nigra）、孝顺竹（Bambusa multiplex）和黄条金刚竹（Sasaella kongosanensis‘Aureostriatus’）为研究对象，分析了毛竹10种候选内参基因在其不同器官和组织中的表达情况。结果发现毛竹的内参基因可以用于其他竹种的相对定量PCR分析。该研究为毛竹内参基因的通用性应用研究提供了理论依据。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 PCR发展简史

1．2．1 技术原理

1．2．2 定量方法

1．2．3 优越性及应用

1．3 内参基因

1．3．1 内参基因应该具备的特点

1．3．2 内参基因在qRT-PCR中的应用

1．3．3 内参基因选择多样性及缺陷

1．4 内参基因稳定性分析方法

1．4．1 GeNorm

1．4．2 Normfinder

1．4．3 BestKeeper

1．5 内参基因选择相关研究进展

1．6 研究目的和意义

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 低温胁迫材料

2．1．2 盐胁迫材料

2．1．3 干旱胁迫材料

2．1．4 其他竹种材料

2．2 实验方法

2．2．1 内参基因的选择与引物设计

2．2．2 总RNA的提取与检测

2．2．3 cDNA合成

2．2．4 目的基因的PCR扩增

2．2．5 qRT-PCR

2．2．6 数据分析

第三章 结果与分析

3．1 内参基因的PCR扩增

3．1．1 毛竹内参基因的PCR扩增

3．1．2 其他竹种内参基因的PCR扩增

3．2 内参基因的Ct值分析

3．2．1 低温胁迫下Ct分析

3．2．2 盐胁迫下Ct分析

3．2．3 干旱胁迫下Ct分析

3．2．4 其他竹种Ct分析

3．3 低温胁迫下内参基因的选择

3．3．1 GeNorm分析

3．3．2 NormFinder分析

3．3．3 BestKeeper分析

3．3．4 最佳内参基因的综合评定

3．3．5 内参基因的验证

3．4 盐胁迫下内参基因的选择

3．4．1 GeNorm分析

3．4．2 NormFinder分析

3．4．3 BestKeeper分析

3．4．4 最佳内参基因的综合评定

3．5 干旱胁迫下内参基因的选择

3．5．1 GeNorm分析

3．5．2 NormFinder分析

3．5．3 BestKeeper分析

3．5．4 最佳内参基因的综合评定

3．6 毛竹内参基因的通用性研究

3．6．1 GeNorm分析

3．6．2 NormFinder分析

3．6．3 BestKeeper分析

3．6．4 最佳内参基因的综合评定

第四章 讨论

4．1 低温胁迫下内参基因的选择

4．2 盐胁迫下内参基因的选择

4．3 干旱胁迫下内参基因的选择

4．4 毛竹内参基因的通用性研究

第五章 结论

参考文献

附录

个人简介

在校期间科研情况

致谢