鳗弧菌感染相关的鮸鱼差异表达基因的miRNA调控研究

摘要

在长期的进化进程中，为抵抗病原生物进化出免疫系统。脊椎动物的免疫系统分为先天性免疫系统(Innate immunity)和获得性免疫系统(Acquired immunity)。Toll/IL-1受体超家族(Toll/IL-1 receptor superfamily)是由TLR家族和IL-1R家族组成。这个新受体家族中的成员都含有Toll同源结构域的TH结构域，是由含有128个氨基酸残基的10段保守序列组成的。这一信号通路成员是重要的模式识别受体，在对抗外来入侵病原体的天然免疫中发挥着重要的作用。MicroRNA(miRNA)是约含22核苷酸的内生非编码的小分子RNA，作为一类负转录调控因子，其可以调控基因的转录后水平。miRNA可以通过特定的结合位点与mRNA的3'非翻译区(3'UTR)通过不完全的互补配对方式引起该基因翻译受阻或者直接降解mRNA，在转录后水平调控基因的表达。在本研究中，通过鮸鱼转录组测序分析获得病原菌感染后的差异表达基因，并对差异表达的Toll/IL-1受体超家族中成员进行了miRNA调控研究，研究结论如下:　　1.我们通过对鮸鱼感染鳗弧菌前后的脾脏cDNA进行转录组测序，对照组(Ctrl)获得51，853，370条raw reads和感染组(Van)获得51，852，199条raw reads。通过与鮸鱼参考基因组序列进行比对筛选，对照组获得34，790，143条匹配的read，Van感染组获得34，526，606条匹配的reads，这些read组装成了47，971条unigenes。然后，对两组样本进行数字表达谱分析，获得差异表达的基因2，482个，其中上调的有1，313个。然后，根据这些差异表达基因的GO功能富集分析及KEGG信号通路富集分析，获得了一些与病原体感染后免疫相关的基因，其中包括Toll/IL-1受体家族的TLR1和IL-1R等，它们都是在鳗弧菌感染下表达量发生显著上调的基因。　　2.本研究发现，IL-1RI在鳗弧菌感染的鮸鱼脾脏组织及LPS刺激的鮸鱼巨噬细胞中的表达量都是显著升高的，进一步证实了IL-1RI在免疫及炎症反应中发挥作用。利用生物学信息学的方法，筛选出了可能与IL-1 RI3'UTR区域结合的miRNA，其中包括miR-192，并对其启动子进行了分析，预测出其可以被转录因子AP-1所调控。通过双荧光素酶报告基因实验发现miR-192可以抑制IL-1RI3'UTR野生型报告质粒的荧光活性，但对突变型无作用，这证实miR-192对IL-1R的抑制效应是严格依赖于“Seed region”与IL-1RI mRNA之间的相互作用。荧光定量分析miR-192在鳗弧菌感染的脾脏组织和LPS刺激的鮸鱼巨噬细胞中的表达量变化与IL-1 RI的变化趋势相反，从而进一步证实miR-192对IL-1RI表达的调节作用。　　3.本研究发现，TLR1在鳗弧菌感染的鮸鱼脾脏组织中的表达量是显著上升的。LPS是脂质和多糖的复合物，是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，对LPS刺激后的鮸鱼脾脏及LPS刺激后的鮸鱼巨噬细胞进行TLR1表达量的分析，发现其表达量是上调的。通过生物学信息学的方法及双荧光素酶报告基因筛选出miR-217可靶作用TLR1的3'UTR。通过miR-217可以抑制TLR13'UTR野生型报告质粒的荧光活性而对突变型无作用，验证了miR-217可以直接靶作用TLR13'UTR的“Seed region”。利用构建的miR-217前体质粒，通过双荧光素酶报告基因实验发现miR-217前体有类似于miR-217模拟体的活性也可以靶作用TLR13'UTR而抑制荧光活性。另外，荧光定量分析miR-217在LPS刺激的脾脏组织和LPS刺激的鮸鱼巨噬细胞中的表达量情况，结果显示其表达量是上调的，表明miR-217可能参与调节机体对LPS刺激的反应。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 鱼类免疫学研究进展

1．1．1 鱼类免疫学发展概况

1．1．2 鱼类的免疫系统

1．1．3 鱼类的免疫机制

1．1．4 鮸鱼概况

1．2．1 Toll／IL-1R家族来源

1．2．3 Toll／IL-1R信号通路

1．3 miRNA的研究进展

1．3．1 miRNA的内源合成

1．3．2 miRNA的作用机制

1．3．3 miRNA的功能

1．3．4 miRNA与免疫系统

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 菌种

2．1．3 细胞及转染相关材料

2．1．4 载体构建所需材料及载体

2．1．5 引物

2．1．6 miRNA模拟体及抑制体

2．1．7 实验仪器

2．1．8 分子生物学软件

2．2 实验方法

2．2．1 鮸鱼巨噬细胞的分离

2．2．2 病原菌感染实验

2．2．3 RNA提取

2．2．4 cDNA合成

2．2．5 cDNA文库构建及测序

2．2．6 Clean read数据的获得与组装

2．2．7 Unigene基因注释及功能分类

2．2．8 基因差异表达分析

2．2．9 miRNA的筛选及靶基因的预测

2．2．10 实时荧光定量PCR分析

2．2．11 质粒构建

2．2．12 转染

2．2．13 双荧光素酶报告基因分析

2．2．14 数据分析

第三章 结果与讨论

3．1．2 序列组装结果与生物信息学分析

3．1．3 基因定量的分析

3．1．4 差异表达基因筛选

3．1．5 差异表达基因GO富集和基因通路富集分析

3．1．6 免疫相关的差异表达基因

3．2 鮸鱼IL-1RI的miRNA调控分析

3．2．2 鮸鱼miR-192的特征分析

3．2．3 miR-192与IL-1RI 3’UTR作用位点的确定

3．2．4 鮸鱼miR-192与IL-1RI表达分析

3．2．5 讨论

3．3 鮸鱼TLR1的miRNA调控分析

3．3．2 鮸鱼TLR1的表达分析

3．3．3 miR-217与TLR1 3’UTR作用位点的确定

3．3．4 miR-217前体与TLR1 3’UTR双荧光素酶检测分析

3．3．5 鮸鱼miR-217的表达分析

3．2．6 讨论

结论

参考文献

致谢

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