酵母乙酸异戊酯水解酶和V型ATP酶F亚基的结构生物学研究

摘要

(I)酿酒酵母乙酸异戊酯水解酶结构与功能研究：
　　 在酿酒酵毋发酵过程中产生的酯类化合物，是决定酒的香气与风味的主要成分。乙酸异戊酯水解酶(Isoamyl Acetate-Hydrolyzing esterase，IAHl)是酵母发酵过程中酯类化合物代谢的一个关键酶，它与醇乙酰基转移酶（alcohol acetyltransferase，ATFase）共通调控着异戊醇与乙酰辅酶A缩合生成乙酸异戊酯的过程。
　　 我们从酵母基因组中克隆了乙酸异戊酯水解酶基因，构建了pET22b载体的重组质粒。表达纯化并结晶了IAH1，在本实验室室内光源收集了一套分辨率为1.60A的晶体衍射数据。同时，表达、纯化并结晶了IAH1硒代甲硫氨酸衍生物蛋白，在北京同步辐射3W1A线站收集了三套MAD数据，分辨率均为2.05A。然后通过MAD法，解析了IAH1晶体的衍射相位，并最终获得了1.6A的高分辨率晶体结构模型。
　　 通过对IAH1晶体结构的分析，我们确定了其酶学分类，属于SGNH-hydrolase家族。与同源结构比对后发现，它们的中央β-折叠片和催化活性残基在结构上高度保守。IAH1是该家族中目前发现的唯一的以二体形式存在的蛋白，同时IAH1与其它成员相比，又含有三个独特的插入序列，且具有各自的生物学功能。
　　 IAH1在晶体和溶液中均以二体存在，实验证明其同二聚体对于蛋白的酶活性和底物特异性有着重要的意义。IAH1所特有的一段C-temimus通过二聚化参与了二聚体中另一亚基酶活性口袋的形成，限制了底物进入酶活中心的路径。
　　 IAH1的活性口袋可以根据其功能分为三层，其中催化三联体所在的中间层催化水解反应的进行，上层与下层结合酯类的疏水性侧链。通过结构模型的分析，推测底物进入活性口袋后，其长的疏水性侧链应当更加倾向于留在活性口袋的上部，甚至延伸至溶剂区。进一步推测Lys52和Trp129可以在底物进入活性中心后，提供疏水性位点结合底物的侧链，对于IAH1的酶活与底物特异性有着重要的意义。
　　 (II)酵母V-ATPase F亚基（VMA7）的初步晶体学研究：
　　 Vacuolar H+-ATPase，或V-ATPase，广泛存在于真核细胞的细胞质膜和细胞器膜系统中，它依赖分解ATP产生的能量作为动力，可以逆浓度梯度将质子泵出细胞外或泵入细胞器内腔，是细胞内囊泡膜系统中最重要的质子泵，对于控制和调节细胞的pH值有着极其重要的生理意义。
　　 V-ATPase是一种多亚基复合物，全酶有十几种小亚基组成。这些小亚基组成了两个大的结构域，一个是具有Atp水解酶活性的膜外结构域V1，一个是负责质子跨膜运转的膜内结构域vo。Vl与Vo之间通过一个中央柄轴结构相连。在酵母中，这一中央柄轴结构由VMA7(F亚基)和VMA8（D亚基）组成，对于V-ATPas全酶的组装和运转有着关键的作用。
　　 我们从酵母基因组中克隆了V-ATPase的F亚基(VMA7)基因，并成功构建了pETDuet载体的重组质粒。表达并纯化了VMA7重组蛋白。利用悬滴气相扩散法筛选出VMA7蛋白晶体的初步生长条件，初筛获得的晶体在上海同步辐射光源(SSRF)BLI7U线站进行X-ray衍射，分辨率约4A左右。根据获得的条件进行了网格法优化，目前工作仍在进行中。

目录

文摘

英文文摘

第一篇 酿酒酵母乙酸异戊酯水解酶的结构与功能研究

第1章 综述：GDSL水解酶家族研究进展

1.1 概述

1.2 GDSL家族酯酶和脂肪酶的结构

1.3 结合底物时蛋白活性口袋构象发生的变化

1.4 GDSL家族水解酶的催化机制

1.5 GDSL家族蛋白的功能

1.6 GDSL系统发生学分析

1.7 GDSL家族水解酶与α/β水解酶家族在结构上的特点与区别

1.8 酵母乙酸异戊酯水解酶(IAH1)简介及研究意义

第二章 实验的材料、设备与方法

2.1 实验材料与设备

2.2 实验方法

第三章 实验结果与讨论

3.1 IAH1表达载体的构建

3.2 IAH1及其突变体的表达与纯化

3.3 IAH1及其硒代蛋白的结晶

3.4 晶体衍射数据的收集和处理

3.5 IAH1晶体结构的解析

3.6 晶体结构模型的质量评估

3.7 IAH1的整体结构

3.8 IAH1的结构分析与讨论

第四章 小结

参考文献

第二篇 酵母V型ATP酶F亚基(VMA7)的初步晶体学研究

第一章 综述：Vacuolar (H+)-ATPases的结构与功能研究

1.1 概述

1.2 V-ATPase的结构特征

1.3 V-ATPase全酶的组装

1.4 V-ATPase的功能

1.5 酵母V-ATPase的F亚基(VMA7)简介及研究意义

第二章 实验的材料、设备与方法

2.1 实验材料与设备

2.2 实验方法

第三章 实验结果与讨论

3.1 VMA7基因组的克隆

3.2 VMA7重组蛋白的表达与纯化

3.3 VMA7重组蛋白的结晶

第三章 小结与展望

3.1 小结

3.2 展望

参考文献

附录

致谢