酵母PLP合成酶Snz1的结构与催化机理研究及家蚕自噬通路的研究

摘要

(Ⅰ)磷酸吡哆醛(PLP)是维生素B6的活性形式，作为多种酶系统的辅酶，在蛋白质和糖类的代谢中起着重要作用。迄今为止，已经报道的PLP的体内合成途径有两种，即脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)依赖途径，和DXP非依赖途径。DXP依赖的合成途径主要存在于大肠杆菌和少量真核生物中，由PDX家族编码的蛋白质(PdxA、B、C、F、H、J和GapA)完成，机理目前已经研究得非常透彻，PLP的合成前体是赤鲜糖-4-磷酸和1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸。DXP非依赖途径主要存在于大部分真菌以及植物等真核生物中，参与该合成途径的蛋白只有两个：Pdx1和Pdx2，它们以复合物的形式行使功能。其中Pdx2亚基为谷氨酰胺酶，Pdx1则是PLP合成酶。体外生化实验证明通过这一途径合成的PLP来源于一个三碳糖和一个五碳糖，最近的研究发现三碳糖是3-磷酸甘油醛(G3P)或者磷酸二羟戊酮(DHAP)，另一个底物五碳糖则是5-磷酸核糖(R5P)或者5-磷酸核酮糖(RBP)，而不同于DXP依赖途径的是，PLP骨架上的亚胺基不是来源于谷氨酸，而是由谷氨酰胺经水解的铵离子提供。
　　 据文献报道，在提供外源氨基的反应体系中，Pdx1可单独催化PLP合成过程中的一系列反应，包括五碳糖、三碳糖的异构、亚胺中间体的生成、氨基加成反应和吡哆环的形成。在Pdx1催化底物生成PLP的过程中，Pdx1与底物五碳糖之间会生成亚胺中间体，后来在枯草芽孢杆菌中得到验证，同时鉴定出是由Pdx1的Lys149与RBP形成的中间体。然而海栖热袍菌Pdxl的结构显示，RBP与Lys80（枯草芽孢杆菌Pdxl的Lys81），而非Lys149，形成shill碱。为了说明这两个保守赖氨酸的作用，作者突变了枯草芽孢杆菌的Lys81和Lys149，体外酶活实验显示，K81A和K149A均丧失了PLP合成的活性，K80A同时还失去了将R5P异构成RBP的能力，但是K149A的异构活性反而更高。这些结果证实，这两个赖氨酸均对Pdx1的PLP合成活性至关重要，同时鉴定出了R5P/RBP的异构化位点是Lys81。然而对于三碳糖的结合位点、异构位点以及PLP的加成位点仍然不清楚。
　　 酵母中被鉴定出来的Pdx1同源基因有三个，包括Snzl、Snz2和Snz3，他们均属于SNZ家族。PDX2同源基因也有三个，分别为SNO1、SN02和SN03，隶属于SNO基因家族。这两个家族编码的蛋白质之间存在多种相互作用关系，其中SNZ2/SN02和SNZ3/SN03参与维生素B1的合成，而SNZ1/SN01则与维生素B6和PLP的合成息息相关。
　　 我们解析了酿酒酵母中Pdxl同源蛋白Snzl(2.30 A)的结构，及Snzl分别与产物PLP(2.20 A)和底物G3P(1.80 A)的复合物结构。在此基础上，我们对结合位点的关键氨基酸进行了定点突变，并且通过体外酶活测定实验进行验证。基于结构分析和体外生化实验分析，我们鉴定出了三个重要的活性位点，分别是PLP合成位点、G3P结合位点和G3P中转位点。同时，在所得结果的基础上，我们提出了Pdx1/Snzl可能的催化机制，即R5P和DHAP分别在各自的位点发生异构反应，然后被转移到PLP合成位点，并在那里与Pdx2提供的氨基共同生成PLP。
　　 (Ⅱ)细胞编程性死亡(PCD: Programmed Cell Death)是一种进化上高度保守的可调控的细胞自杀机制，负责清除衰老、无用或者病变的细胞，从而维持有机体的正常生命活动。细胞编程性死亡主要包括两种形式，即凋亡(Apoptosis)和自噬(Autophagy)，也被分别称为Ⅰ型和Ⅱ型细胞编程性死亡。自噬作为Ⅱ型细胞程序性死亡，其细胞形态表现为细胞浆中自噬体的出现、溶酶体的激活和自噬溶酶体的形成。自噬广泛存在于真核细胞内，以溶酶体降解的形式参与细胞内物质的循环，特别是绝大多数长半衰期蛋白质的降解。
　　 自噬体的形成依赖于两个重要的泛素样结合通路(ubiquitin-likeconjugation systems)，分别是Atg8-磷脂酰乙醇胺(PE：phosphatidylethanolamine)通路和Atg12-Atg5-Atg16通路。自噬的调控则依赖于一些信号转导通路以及蛋白质复合体，包括TOR（雷帕霉素受体）信号通路、PI3K-I(磷脂酰肌醇三磷酸激酶Ⅰ)/Akt通路以及PI3K-Ⅲ蛋白复合体。TOR通过激活下游的一系列调控因子，进而影响相关蛋白的转录和调控，起到抑制自噬发生的作用；PI3K-I/Akt通路的激活可以抑制TSC2的GTP酶活性，使其无法将Rheb-GTP转化为Rheb-GDP，而Rheb-GDP是TOR的负调控因子，因此PI3K-I/Akt通路通过激活TOR通路发挥抑制自噬的功能；而同属于PI3K家族的PI3K-Ⅲ，与其膜受体及Atg6(哺乳动物Beclinl)形成复合物，是自噬的正调节因子，尤其在自噬体形成的早期发挥了重要的作用。
　　 自噬参与调控了生物体的生长发育和细胞分化等过程，协助细胞对抗恶劣环境的胁迫，同时对防止某些疾病如肿瘤、肌病、神经退行性疾病以及在抵御病原微生物的感染和延缓衰老等方面发挥了重要的作用。此外，自噬还与昆虫的变态发育过程息息相关。昆虫从幼虫到蛹的变态发育过程涉及某些原有组织的消退，比如果蝇的唾液腺，家蚕的前胸腺和丝腺组织。丝腺是五龄家蚕体内体积最大的组织，包括前部(ASG)、中部(MSG)和后部丝腺(PSG)三个部分。在蛹前期，由蜕皮激素激活的细胞编程性死亡机制促使了丝腺组织的退化和降解。有文献报道，家蚕的ASG在5龄第一天开始分化，第三天可以观察到细胞死亡的现象，5龄后期则出现了自噬和凋亡的特征，这些现象说明自噬和凋亡同时参与了丝腺的分化和降解过程，但是二者之间的关系尚不清楚。不仅仅是在ASG细胞中存在自噬，华南农业大学动物科学院的曹阳教授研究组通过组织切片和电镜技术在MSG细胞中也发现了自噬体和自噬溶酶体结构。这些结果说明自噬很可能在家蚕丝腺的分化与降解过程中发挥了非常重要的作用，但是具体的分子机制还不清楚。因此我们通过生物信息学分析找到了家蚕中的自噬相关蛋白，希望能够构建出家蚕的自噬通路，为将来系统的研究这些蛋白奠定基础。
　　 我们通过一系列生物信息学分析，利用序列比对的方法在家蚕数据SilkDB中找到了20多个自噬相关基因，并且基于酵母和哺乳动物的自噬机制初步重构了家蚕中的自噬通路。这个自噬通路可以进一步划分为上游的信号转导通路和下游的两个重要的ubiquitin-like结合通路。我们通过RT-PCR的方法证实了一些重要的自噬相关基因在丝腺中的表达，肯定了自噬机制在丝腺组中的作用。此外，为了验证蛹前期家蚕丝腺中自噬水平的变化，我们针对两个自噬的标志性基因BmAtg8和BmAtg12，进行了不同时间节点的半定量PCR实验。结果显示，从五龄的第一天到第八天，随着丝腺组织的成熟和分化，这两个基因的转录水平呈现明显的上升趋势。综上所述，在转录水平上，自噬基因在五龄期随着时间推移而被上调。由此我们推断，自噬在家蚕的变态发育过程中发挥了重要的作用。

目录

文摘

英文文摘

第一部分 酵母PLP合成酶Snz1的结构与催化机理研究

第一章 PLP合成酶的研究背景

1.1 引言

1.2 PLP合成酶及其生物机制概述

第二章 实验材料、设备与方法

2.1 实验材料与设备

2.2 实验方法

第三章 结果与讨论

3.1 Snzl的表达与纯化

3.2 Snzl及其突变体的CD结果

3.3 Snzl的晶体学研究

3.4 Snzl的晶体结构与活性位点

3.5 基于结构的酶活实验

3.6 基于结构与生化的反应机理推断

本篇小结

参考文献

第二部分 家蚕自噬通路的研究

第四章 背景介绍

4.1 自噬概述

4.2 自噬的分子机制

4.3 自噬的研究方法

4.4 家蚕的变态发育与自噬

4.5 酵母Atg3-Atg8的背景介绍

第五章 实验材料、设备与方法

5.1 实验材料与设备

5.2 实验方法

第六章 结果与讨论

6.1 家蚕自噬通路及部分基因的鉴定

6.2 酵母自噬蛋白Atg3-Atg8复合物的晶体学研究

本篇小结

参考文献

附录

A： pET28b(+)载体图谱

B： 引物设计规则

C： 大肠杆菌感受态的制备

D： 实验原理简介

致谢

攻读学位期间发表的学术论文与参加的学术会议