LFcinB肽衍生物改善胰岛素抵抗作用及相关机制的初步研究

摘要

研究背景:　　目前，2型糖尿病患者以惊人的速率逐年增加，成为继心血管疾病、肿瘤之后的第三大非传染性疾病。2型糖尿病[1]主要表现为高血糖，是一类由多因素引发的复杂代谢性疾病，前期的研究表明2型糖尿病的致病原因与胰岛慢性炎症、自身免疫有关，可能会引发糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、心脑血管疾病等严重并发症。2型糖尿病的主要发病原因之一是胰岛素抵抗(Insulin Resistance)，究其原因是机体对胰岛素的敏感性下降，造成血糖水平异常升高，从而导致糖代谢的失衡[2]。因此，研究降血糖类药物成为科研人员的当务之急。半乳糖凝集素-3（Galectin-3，Gal-3)，属于糖粘合蛋白家族，作为糖尿病肾病的良好生物标记因子，可以为糖尿病的防治及预后提供判断依据。近期有资料表明Galectin-3与胰岛素抵抗的形成有直接联系，认为其直接阻碍了胰岛素与胰岛素受体的结合从而导致下游通路不能正常进行以至于葡萄糖转运子（Glut-4）不能从胞质内转位到细胞膜上使葡萄糖输出失常从而导致血糖浓度升高引起胰岛素抵抗，因此得出结论Galectin-3可能通过影响胰岛素受体信号通路以及炎症基因的表达来引起胰岛素抵抗。因此，将Galectin-3作为糖尿病创新药物治疗的新靶点具有非常巨大的前景。牛乳铁蛋白(Bovine lactoferricin，LfcinB)，是从牛乳中水解出的具有多种生物效应性的单体糖蛋白，前人的研究发现它具有显著的抗菌和抗肿瘤活性，但最近研究发现LFcinB的抗菌活性中心氨基酸序列LFcinB4-9 RRWQWR有报道表明其作为ACE酶抑制剂发挥降压肽的作用，也可能具有潜在的降糖活性甚至与胰岛素抵抗有某种联系，但是具体通过的相关机制现目前并没有相关报道。　　基于以上研究背景，本实验的目的是研究基于阳离子乳铁蛋白肽 LFcinB64-9 (RRWQWR) 设计的拟肽,对人肝癌细胞和小鼠脂肪细胞在胰岛素抵抗状态下葡萄糖代谢的影响，并探究其影响机制。本课题在前部分工作按照抗菌肽模式序列要求、优势位点的氨基酸结构进行化学修饰，开展降糖肽的虚拟组合设计，并通过定量构效关系分析实现其高通量筛选对LFcinB进行一系列化学修饰改造，使其可能具有缓解胰岛素抵抗的作用。为此，改造后修饰得到若干条结构新颖的乳铁蛋白拟肽衍生物与Galectin-3 进行对接筛选与其契合的拟肽。筛选出打分高的拟肽进行合成，合成的拟肽进行体外改善胰岛素抵抗活性初步测定及相应降糖机制的探讨，研究拟肽对脂肪细胞3T3L1、胰岛素靶细胞HepG2胰岛素抵抗模型的影响。为寻找新型降糖肽药物提供了新的思路和实验依据。　　目的:　　以Galectin-3为靶点筛出的LFcinB拟肽衍生物测试是否对胰岛素抵抗状态下的肝癌细胞和脂肪细胞有葡萄糖消耗及脂肪分化等葡萄糖代谢活动有影响，观察其是否对糖代谢紊乱具有改善作用，如果有初步探讨该作用产生背后的机制。　　方法　　1）从PDB库中下载Galectin-3蛋白受体，将实验室前期筛选出的7条LFcinB拟肽进行分子对接打分筛选出拟合度较好的合成备选拟肽。　　2）固相合成以上多肽，对合成结果进行结构和纯度鉴定。　　3）采用高浓度胰岛素长时间诱导建立具有良好胰岛素抵抗性的 HepG2/IR 细胞模型及地塞米松、胰岛素、异丁基-甲基-黄嘌呤诱导建立具有胰岛素抵抗性的3T3L1/IR细胞模型模型。　　4）GOD-POD 法测定细胞模型葡萄糖消耗量，观察筛选出拟肽对胰岛素抵抗细胞葡萄糖消耗的影响，对拟肽衍生物做出进一步筛选以做后续实验。　　5）油红-O 染色法测定筛选出的拟肽衍生物对脂肪细胞的分化影响，从而观察LFcinB拟肽衍生物对体重增加的影响。　　6）CCK8法测细胞增殖抑制率实验评估所筛选出LFcinB拟肽对细胞的毒性作用。　　7) Western-Blot 蛋白免疫印迹法检测 LFcinB 拟肽衍生物及对照组对Galecin-3,IRS-1,pIRS-1,pAKT,pGSK-3β,Glut-4蛋白表达的影响。　　8）荧光免疫显微镜观察拟肽对胰岛素抵抗3T3L1细胞膜上Glut-4转位的直接影响。　　实验结果:　　1）以Galectin-3为蛋白质受体分子对接打分的方式按照打分结果综合考虑合成成本合成出R1、2、3、5、7号5条包括模板肽在内的拟肽衍生物。　　2)用 1μmol/L 胰岛素持续诱导 HepG2 细胞 24h 成功建立胰岛素抵抗模型HepG2/IR，且胰岛素抵抗持续36h。用GOD-POD法测试细胞葡萄糖消耗实验表明，合成出的R7号肽RWR-EtBn在浓度为100μmol/L对葡萄糖消耗有显著促进作用，且在1μmol/L 浓度作用也明显，持续12h。筛选出LFcinB衍生物改善葡萄糖消耗量效果最显著的R7号拟肽进行下一步实验。　　3）R7号肽RWR-EtBn能抑制3T3L1细胞增殖分化为成熟脂肪细胞，且呈浓度依赖性抑制关系，说明R7号肽有潜在的减脂活性。　　4）CCK8测细胞增殖抑制实验表明拟肽R7号对脂肪细胞3T3L1几乎无毒性作用，且生物安全度高于R1号模板肽和罗格列酮。　　5）Western blot蛋白免疫印迹实验表明拟肽R7号肽RWR-EtBn与R1号模板肽RRWQWR-NH2都可以对糖尿病生物标记因子Galectin-3在肝癌细胞HepG2蛋白表达产生随浓度升高的抑制作用，但R7号肽作用较阳性药物和模板肽明显增强，且R7号肽可能通过胰岛素受体信号通路实现改善胰岛素抵抗,降低血糖水平，调节葡萄糖代谢作用。　　6）免疫荧光实验表明R7号拟肽对Galectin-3的蛋白表达有降低作用及葡萄糖转运蛋白Glut-4在细胞膜上的转位有促进作用。　　研究结论:　　实验设计出拟肽在建立的人肝癌细胞 HepG2 胰岛素抵抗体外模型表明,在 100μmol级别R7号肽对葡萄糖消耗有明显促进作用，对3T3L1分化为成熟脂肪细胞有浓度依赖性抑制作用，说明拟肽能改善体重增加，结合以上功能性试验初步判断筛选出R7号拟肽对胰岛素抵抗状态的葡萄糖代谢有改善作用，且该作用优于阳性药罗格列酮和1号模板肽。且对糖尿病肾病生物标记因子Galectin-3的蛋白表达有浓度依赖性降低作用。LFcinB 肽衍生物 R7 改善胰岛素抵抗的作用机制可能是通过激活IRS-1-pAKT-pGsk-3β-Glut-4 胰岛素受体通路，最终促进 Glut-4 从细胞胞浆转位至细胞膜表面。

目录

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1 引言

1.1 糖尿病

1.2 Galectin-3与2型糖尿病

1.3 糖尿病主要葡萄糖代谢机制研究

1.4 牛乳铁蛋白简介

1.5 计算机辅助药物设计

1.6 课题研究技术路线

1.7 课题研究意义

2 降糖肽分子对接和药物合成

2.1 实验数据来源与设备

2.2 实验结果讨论

2.3结果分析

3 拟肽对胰岛素抵抗细胞葡萄糖代谢的影响

3.1实验材料、仪器及试剂

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 实验结果分析

4 LFcinB衍生物影响胰岛素受体及相关信号通路转导机制机理研究

4.1实验试剂与设备

4.2方法

4.3 实验结果

4.4 实验结果分析

5 荧光免疫法检测拟肽对GLUT-4细胞膜转位的蛋白表达

5.1 材料和设备

5.2 实验结果

5.3 实验结果分析

6 结论与展望

致谢

参考文献

个人简历、在校期间发表的学术论文及取得的研究成果