肺炎链球菌ApnA水解酶SapH和酵母Ap4A磷酸化酶Apa2的结构酶学研究

摘要

二腺苷多聚磷酸(diadenosine polyphosphate，ApnAs)是一种核苷酸衍生物，主要由氨酰tRNA合成酶催化合成，是蛋白质合成过程的副产物。它广泛存在于各种生物中，作为细胞内和细胞外的调控分子发挥着重要的生理功能。这种核苷酸的在体内的积累会对一些关键酶如腺苷酸激酶和蛋白激酶等的活性有抑制作用，因此，生物体内ApnA的降解途径对保持细胞内这类核苷酸的稳态是非常重要的。
　　从原核到真核生物都存在着特异性的酶催化ApnA的降解，但在不同的物种中有所差别。降解ApnA的酶主要分为以下几大类:Nudix(nucleoside diphosphate linked to x)超家族蛋白，HIT(histidine triad)超家族蛋白以及金属磷酸二酯酶超家族蛋白(metallophosphodiesterase，MPP)。我们选取肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）R6菌株的SapH/Spr1479以及酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)Apa2为研究目标，其分别属于MPP超家族和HIT超家族蛋白，均具有降解ApnA的功能，认为在参与ApnA的代谢过程有重要作用。
　　SapH是肺炎链球菌R6菌株中的一个分子量为33kDa的功能未知的蛋白。我们通过X-射线晶体学的方法解析了其apo-form，以及结合无机磷酸和AMP的复合物结构，分辨率分别为1.90(A)，2.30(A)和2.20(A)。SapH的核心结构采用四层的α-β-β-α折叠模式，这与MPP超家族蛋白类似。我们通过原子吸收和X-射线反常散射的方法鉴定出其活性中心的双金属为Fe3+和Mn2+，并且其与周围配位的残基形成正八面体的构象。酶活实验显示SapH除了具有典型的磷酸二酯酶的通用底物bis-(p-nitrophenyl)phosphate的水解活性外，还具有水解ApnA以及ATP的活性。突变试验表明金属配位的残基对于以上两种活性都是必须的。然而在复合物的结构中结合磷酸的Trp67仅在链球菌中保守，而且仅对ApnA和ATP的水解活性是不可或缺的。同时序列分析表明AMP的结合残基仅在链球菌中是保守的，因此SapH是链球菌特有的一个双功能酶。
　　酿酒酵母降解Ap4A主要由两个同源性60％的Ap4A磷酸化酶(Apal和Apa2)完成。Apal和Apa2能可逆地催化Ap4A磷酸解为ATP和ADP，单独缺失apal,apa2以及双缺失apal和apa2虽然对酿酒酵母的生长没有太大影响，但都会导致细胞内的Ap4A浓度升高。我们通过X-射线晶体学的方法解析了Apa2的结构以及H161A突变体与Ap4A复合物的结构，分辨率分别为2.3(A)和2.6(A)。Apa2采用α/β折叠模式，核心的β-sheet类似HIT超家族中的GalT(galactose-1-phosphate uridylyltransferase)家族蛋白，然而额外的亚结构域在Apa2中是特有的，同时也参与形成Ap4A的结合口袋。Ap4A的结合口袋可以分为AMP和ATP两个部分，二者在α-磷酸基团处以互相垂直的方式形成转角，进而将α-磷酸基团暴露给亲核攻击的催化残基His161，因此Apa2采用类似的GalT家族的双底物乒乓反应催化机制。活性检测显示Apa1对Ap4A的相对活性仅为Apa2的1/7。其较低的活性主要是由于Apa2中稳定AMP部分的腺嘌呤的Phe68被Apa1的Leu67取代。通过活性分析发现Apa2对Ap4A的活性最高，kcat/Km为21.0s-1μM-1。Apa2也具有磷酸解Ap3A和Ap5A的活性，但相对活性仅为Ap4A的1/12和1/3。由于Apa2的活性口袋能刚好容纳下Ap4A，所以Ap4A为其最适底物。序列比对表明Apa2在进化上代表了GalT家族的一个新的分支。我们不仅解析了HIT超家族中的第一个典型的Ap4A磷酸化酶的结构，而且是第一个HIT超家族中与Ap4A复合物的晶体结构。

目录

声明

摘要

第一部分 肺炎链球菌ApnA水解酶SapH的结构酶学研究

第一章 SapH研究背景

1．1 引言

1．2 ApnA水解酶

1．3 磷酸酯酶

第二章 实验材料、设备与方法

2．1 实验材料与仪器设备

2．2 实验方法

第三章 结果与讨论

3．1 SapH的结晶、数据收集、结构解析及修正

3．2 SapH的整体结构及活性位点

3．3 活性鉴定

3．4 底物结合口袋

3．5 SapH结构和功能总结

小结

参考文献

第二部分 酿酒酵母Ap4A磷酸化酶Apa2的结构酶学研究

第四章 Ap4A磷酸化酶研究背景

4．1 引言

4．2 HIT(histidine triad)超家族蛋白概述

第五章 材料与方法

5．1 重组质粒的构建(此部分工作由李文哲师姐完成)

5．2 蛋白的表达与纯化(此部分工作由侯文韬完成)

5．3 蛋白质结晶，晶体优化与数据收集

5．4 结构解析，模型构建及结构修正

5．5 活性测定(此部分工作由侯文韬完成)

第六章 结果与讨论

6．1 Apa2的结晶、数据收集、结构解析及修正

6．2 Apa2的整体结构及结构比较

6．3 Apa2的活性位点分析

6．4 Apa2结构与功能分析总结

小结

参考文献

第三部分 合作项目

第七章 其他工作

7．1 肺炎链球菌Endo-β-D-己糖苷酶Spr0440的晶体生长和结构解析

7．2 肺炎链球菌糖基水解酶StrH的结构解析，功能分析和文章撰写工作(与余维丽合作)

7．3 肺炎链球菌糖基转移酶GtfA的结构解析和功能分析(与师伟伟合作)

7．4 调控鱼腥蓝细菌异型胞分化的转录因子及相关蛋白的结构解析(与赵梦溪和胡海汐合作)

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文与参加的学术会议