经全反式维甲酸干预诱导的鼠胚神经干细胞联合鼠神经生长因子移植治疗脊髓损伤大鼠研究

摘要

目的：单纯应用神经干细胞（neural stem cells）移植治疗脊髓损伤的相关动物实验并不理想，因此在实验中提高移植神经干细胞分化为神经元的比例被认为是提高干细胞移植疗效的潜在手段。既往大量研究已经证实全反式维甲酸（all-trans retinoic acid）可以促进动物体内神经细胞的再生和修复，并可显著提高神经干细胞向神经元分化的比率。神经生长因子（nerve growth factor）是最重要的神经营养因子之一，它具有营养神经和促进突触生长的双重生物学功能，其对神经元细胞功能特性的发育、生长和表达，以及对受损神经组织的再生和修复均具有重要的临床意义。本研究通过体外应用1.0μmol/L全反式维甲酸干预诱导培养鼠胚神经干细胞联合鼠神经生长因子移植至脊髓全横断损伤模型大鼠的损伤区域，观察其对大鼠脊髓损伤后神经再生和功能恢复的疗效和影响。　　方法：(1)取本课题组前期提取的冻存鼠胚神经干细胞，将冻存细胞复苏后，放置于恒温培养箱内传代培养。以免疫荧光染色法鉴定神经干细胞特异性表面标志物Nestin、NSE及GFAP抗体的表达。将NSCs分为两组，一组在含1.0μmol/L ATRA的培养液中诱导培养7天；另一组未接受ATRA诱导采用正常培养基培养7天。（2）实验用雌性SD大鼠共72只，10周龄，体重200-250克，随机分为6组，每组12只。六个实验组分别为假手术组（Sham-operation group）、损伤对照组（Injury control group）、未干预的NSCs移植组（Non-treat NSCs group）、单纯NGF组（NGF-only group）、单纯ATRA移植组（ATRA intervention only group）、ATRA+NGF组。将所有实验大鼠用2%戊巴比妥钠（30mg/kg）腹腔注射麻醉，制备胸段脊髓全横断损伤模型（T10-T12）。假手术组仅切除椎板，暴露蛛网膜，未损伤脊髓组织，其他组以尖刀破坏T10-T12节段脊髓组织。脊髓全横断模型建立7天后再次行手术移植神经干细胞。调整待移植NSCs的浓度为2×105个/μL,在移植前一天对所有接受ATRA诱导干预的NSCs进行BrdU标记。未干预的NSCs移植组经造模时留置的导管注射10μL未接受ATRA诱导干预的NSCs,其他干细胞移植组注射10μL接受ATRA诱导的NSCs。给予假手术组，损伤对照组和单纯NGF组注射相同体积的DMEM/F12培养液。在移植当天起，连续7天给予NGF单纯组和ATRA+NGF组导管注射神经生长因子(3μg·kg-1·d-1)，其他组动物根据其自身体重经导管注入相同体积的生理盐水连续7天。（3）实验动物于造模前1天、造模后7天、移植后第1周、第2周、第5周和第8周分别完成Basso Beattie Bresnahan运动评定评估大鼠后肢运动功能的变化，于移植后1、2、5、8周进行斜扳试验，作为运动功能评估的补充。于造模前1天、造模后7天、移植后1、2、5、8周实施双下肢神经电生理检查，记录各组不同实验节点SEP潜伏期时间，并在移植后第8周记录各组大鼠体感诱发电位波形和振幅；在移植后8周神经电生理检查结束后进行心脏灌注，取损伤区域脊髓组织行苏木素-依红（HE)染色，并对组织切片进行形态学观察，同时取损伤组织区域组织切片行BrdU/GFAP和MAP-2/GFAP免疫荧光检测以追踪标记移植细胞的分化与分布，观察损伤组织区域神经胶质细胞和神经元的分布情况。(4)采用SPSS17.0进行统计学分析。采用Kolmogorov Smirnov检验确定数据的正态性。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。　　结果：（1）经复苏的NSCs在传代培养后呈现Nestin阳性，体外应用1.0μmol/L ATRA进行干预诱导或未干预诱导的两组NSCs均可表达NSE和GFAP抗体阳性。（2）运动功能评估显示在移植后第2、5、8周，未干预的NSCs移植组和NGF单纯组BBB评分高于损伤对照组；接受ATRA诱导的两组评分均高于损伤对照组、未处理的NSCs移植组和NGF单纯组，差异有统计学意义。移植后第5周起，ATRA+NGF组BBB评分高于单纯ATRA干预组，差异有统计学意义。斜板试验显示ATRA+NGF组运动功能的恢复情况优于ATRA干预组，ATRA干预组优于未干预的NSCs组和NGF单纯组，损伤对照组运动功能恢复情况最差。（3）神经电生理检查提示移植后第8周，ATRA+NGF组SEP潜伏期显著低于单纯ATRA干预组。此外同未干预的NSCs移植组和单纯NGF组相比，经ATRA诱导的两组实验动物显示更短的SEP潜伏期；未干预的NSCs移植组和单纯NGF组SEP潜伏期明显短于损伤对照组，差异有统计学意义。移植后第8周，各组大鼠SEP波形和振幅显示假手术组SEP波形和振幅完全正常；损伤对照组的振幅极小；单纯ATRA干预组波形接近正常，但振幅小于假手术组；ATRA+NGF组波形接近正常，振幅高于单纯ATRA干预组，但并未达到假手术组的水平；未干预的NSCs移植组波形接近正常，但振幅小于单纯ATRA干预组；单纯NGF组波形接近正常，振幅接近于未干预的NSCs移植组。（4）移植后第8周各组脊髓组织苏木精-伊红染色光镜下显示假手术组灰质和白质界限清晰，神经纤维束排列良好；损伤对照组损伤部位脊髓组织破碎，神经胶质形成瘢痕，神经元坏死，出现大量空腔和囊腔；单纯ATRA干预组在正常与受损脊髓组织交界处可发现大量胶质瘢痕，空腔和囊腔小于损伤对照组，但大于ATRA+NGF组；ATRA+NGF组中可见大量细胞增殖，有较小的空腔和囊腔；未处理的NSCs移植组细胞增殖及星形胶质细胞数量较多，部分可见胶质瘢痕；单纯NGF组可观察到一定数量的空腔和囊腔，但体积小于损伤对照组。（5）免疫荧光双标显示在假手术组，损伤对照组，未干预的NSCs组和单纯NGF组中未观察到BrdU阳性细胞。ATRA诱导两组可见BrdU阳性细胞，单纯ATRA干预组阳性细胞数少于ATRA+NGF组，差异有统计学意义。各组GFAP阳性细胞均分布于脊髓灰质和白质交界部位周围，胞体向外延伸，呈放射状突起，部分神经胶质细胞交织成网状结构。ATRA诱导组中GFAP阳性细胞数量少于其他组；未处理的NSCs移植组和单纯NGF组阳性细胞均少于假手术组和损伤对照组，但高于ATRA诱导组；ATRA+NGF组阳性细胞数量小于单纯ATRA干预组；以上差异均有显著统计学意义。ATRA诱导两组MAP-2阳性细胞多于其他组，单纯ATRA干预组MAP-2阳性细胞少于ATRA+NGF组，差异有统计学意义。未处理的NSCs移植组和单纯NGF组MAP-2阳性细胞均多于假手术组和损伤对照组，差异有统计学意义。　　结论：在SD大鼠动物实验中（1）于脊髓损伤区域单一应用NSCs移植或NGF注射可以对损伤后运动功能恢复产生促进作用。（2）经ATRA干预诱导可促进移植NSCs分化为神经元，其对损伤后运动功能恢复的促进效果优于单一应用未干预的NSCs移植或NGF注射。（3）经ATRA干预诱导的NSCs联合NGF移植可促进神经干细胞分化神经元的存活和迁移，促进局部轴突的生长，并抑制胶质瘢痕的形成。其促进脊髓损伤大鼠运动功能恢复的疗效，比单用经ATRA诱导的NSCs移植更加显著。

目录

前言

材料与方法

1.1 实验步骤

2.1 主要实验试剂

2.2主要实验仪器

2.4 实验动物

3 细胞培养和移植

3.1 神经干细胞的诱导分化和鉴定

3.2 神经干细胞的移植和神经生长因子注射

3.3 实验动物的护理

4 运动功能测试

4.1 Basso Beattie Bresnahan (BBB)运动评定

3.2 斜板实验评估双后肢运动功能

4 神经电生理检查

5 组织学和免疫荧光染色

6 统计分析

结果

1 NSCs的鉴定及ARTA干预诱导NSCs分化

2 BBB评分评估大鼠双下肢运动功能

3 斜板试验结果

4 神经电生理检查结果

4.1体感诱发电位（SEP）检查结果

4.2 体感诱发电位（SEP）波形和振幅

5 组织学HE染色光学显微镜结果

6 免疫荧光染色结果

6.1 BrdU免疫荧光染色

6.2 GFAP免疫荧光染色

6.3 MAP-2免疫荧光染色

讨论

1.神经干细胞移植的优势和不足

2.全反式维甲酸干预诱导鼠胚神经干细胞的原理和机制

3.神经生长因子治疗脊髓损伤的意义

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综述:锂对干细胞作用影响的研究进展

声明