超声造影评估L-精氨酸对大鼠肾缺血再灌注损伤的实验研究

摘要

目的：应用超声造影（contrast enhanced ultrasound，CEUS）技术定量评估L-精氨酸对大鼠肾缺血再灌注损伤肾皮质血流灌注的影响，分析肾皮质时间－强度曲线（time intensity curve，TIC）定量参数与生化指标的相关性并评价L-精氨酸对大鼠肾血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cysteine aspartic protease1，Caspase-1）表达的影响，探讨超声造影技术在评价药物干预肾缺血再灌注损伤疗效中的应用价值。　　方法：24只健康成年雄性SD大鼠随机分成假手术组（S组）、缺血再灌注组（I/R组）和L-精氨酸组（L-arg组），每组8只。S组仅单纯切除右肾，I/R组和L-arg组采用切除右肾夹闭左肾制备大鼠左肾缺血再灌注损伤模型。L-arg组于缺血前30min鼠尾静脉给予L-精氨酸注射液300mg/kg，S组和I/R组经尾静脉注射等量生理盐水。再灌注24h后行常规二维超声及超声造影检查，常规二维超声测量左肾大小及皮质厚度，随后进行超声造影检查。造影完毕后运用内置分析软件对肾皮质感兴趣区域（region of interest，ROI）TIC曲线参数进行定量分析。分析参数包括峰值强度（peak intensity，PI）、达峰时间（time to peak，TTP）、曲线下面积（area under the curve，AUC）和平均渡越时间（mean transit time，MTT）。造影结束后，收集血液标本，用于测定血肌酐（serum creatinine，SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血胱抑素C（serum cystatin C，SCys-C）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）及谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）浓度。取血完毕后，即刻处死大鼠并切除左肾及肝组织，肝及部分肾组织标本制成石蜡切片，HE染色后病理观察；部分肾组织于-80℃条件下冷藏备用。免疫组化法检测肾组织Caspase-1表达水平，实时定量PCR技术检测肾组织VEGF mRNA表达变化。统计学方法采用单因素方差分析，双变量Pearson直线相关用于分析TIC曲线定量参数与实验室检测指标的相关性。　　结果：实验大鼠麻醉效果良好，造模及造影顺利。1.二维超声显示大鼠左肾轮廓清晰、形态规则、包膜完整、实质回声均匀，各组大鼠左肾大小及皮质厚度如下：（1）S组：肾脏大小约（15.98±0.35）×（10.19±0.35）mm2，皮质厚度约（2.08±0.15）mm；（2）I/R组：肾脏大小约（17.16±0.50）×（10.70±0.45）mm2，皮质厚度约（2.30±0.15）mm；（3）L-arg组：肾脏大小约（16.49±0.45）×（10.39±0.24）mm2，皮质厚度约（2.18±0.20）mm。组间两两比较结果显示：I/R组和L-arg组左肾长径较S组增加，L-arg组左肾长径较I/R组减小，差异有统计学意义（P＜0.05）；I/R组左肾前后径及皮质厚度较S组增加，差异有统计学意义（P＜0.05），S组与L-arg组、I/R组与L-arg组左肾前后径及皮质厚度比较无统计学差异。2.三组大鼠TTP、AUC、MTT值比较差异均有统计学意义。与S组比较，I/R组和L-arg组TTP、MTT延长，AUC增加（P＜0.05）；与I/R组比较，L-arg组TTP、MTT缩短，AUC减小（P＜0.05）。L-arg组大鼠PI值高于I/R组（P＜0.05），S组与L-arg组、S组与I/R组组间PI值比较无统计学差异。3.血清SCr、BUN、SCys-C、ALT及AST浓度在I/R组和L-arg组中显著升高；与I/R组比较，L-arg组血清SCr、BUN、SCys-C浓度降低，血清ALT水平升高；I/R组和L-arg组组间AST浓度比较无统计学差异。4.缺血再灌注期间肾组织VEGF、Caspase-1表达水平升高，L-精氨酸显著上调VEGF表达水平，抑制Caspase-1表达活性。5.双变量Pearson直线相关分析显示TIC曲线参数TTP、MTT及AUC与实验室生化指标均存在相关性，其中TTP与SCr、BUN及SCys-C呈高度正相关（r=0.899、0.847、0.819，P=0.000、0.000、0.000）、AUC与SCr呈高度正相关（r=0.828，P=0.000）、MTT与SCr呈高度正相关（r=0.849，P=0.000）；AUC与BUN、SCys-C分别呈中度相关（r=0.733、0.785，P=0.000、0.000），MTT与BUN、SCys-C分别呈中度相关（r=0.765、0.789，P=0.000、0.000）；TIC曲线定量参数PI与生化指标无相关性。　　结论：1.超声造影定量技术可以反映大鼠肾缺血再灌注损伤前后肾皮质血流灌注信息，定量评估L-精氨酸对缺血再灌注肾皮质血流灌注的影响。2.造影参数联合实验室生化检查可以有效、较为敏感的反映缺血再灌注肾功能损伤程度，以造影参数TTP、MTT及AUC更具参考意义。3.L-精氨酸通过上调肾组织VEGF、抑制Caspase-1表达来减轻大鼠肾缺血再灌注损伤。

目录

前言

材料与方法

1 实验动物与分组

2 主要实验试剂及药品

3 主要实验仪器及设备

4 实验方法

4.1 肾缺血再灌注损伤模型的建立

4.2 超声检查

4.3 肝肾功能检查

4.4 病理形态学观察

4.5 RT-PCR法检测肾组织VEGF表达水平

4.6 免疫组化法检测肾组织Caspase-1表达含量

5 统计学分析

结果

1 造模质量评价

2 二维超声检查结果

3 肾血流灌注超声造影实时观察

4 TIC曲线参数分析

5 实验室检查结果

6 肾组织VEGF、Caspase-1表达含量分析

7 TIC曲线参数与实验室生化指标相关性分析

8 肝肾组织病理结果观察

讨论

1 肾缺血再灌注损伤

2 肾缺血再灌注损伤细胞生物学特征

3 肾缺血再灌注损伤的监测

4 超声造影在肾缺血再灌注损伤中的应用

5 L-精氨酸在肾缺血再灌注损伤中的作用

结论

参考文献

英文缩略词对照表

硕士研究生期间发表的论文

致谢

综述:L-精氨酸/NO在肾缺血再灌注损伤中的作用

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