积雪草苷抑制TLR4/NF-κB信号通路减轻Aβ1-42诱导hBMECs凋亡

摘要

目的：人脑微血管内皮细胞(Human Brain Microvascular Endothelial Cells，hBMECs)凋亡是阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）发病机制之一。hBMECs是血脑屏障(Blood Brain Barrier,BBB)的主要成分之一，β淀粉样肽1-42(amyloid-β1-42，Aβ1-42)通过诱导hBMECs凋亡引起血脑屏障通透性增加，沉积于神经元细胞，导致神经元变性坏死，功能受损，促进AD的发生发展。Aβ诱导hBMECs凋亡机制目前并不清楚，可能与TLR4/NF-κB信号通路激活有关。积雪草苷(Asiaticoside，AS)具有抗炎，抗氧化以及抗凋亡作用，但对Aβ诱导的hMECs凋亡有无抑制作用及作用机制是否与抑制TLR4/NF-κB信号通路激活有关并不清楚。因此，本研究通过建立Aβ诱导hBMECs细胞凋亡模型，探索积雪草苷对Aβ1-42诱导hBM ECs凋亡的作用，并阐明其作用机制，为积雪草苷用于预防阿尔茨海默病提供理论依据。　　方法：(1)积雪草苷干预浓度选择：用不同浓度积雪草苷(3.125μmol/L，6.25μmol/L,12.5μmol/L,25μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,200μmol/L)分别处理hBMECs6h，12h，24h，48h，CCK-8法检测hBMECs细胞活性。(2)Aβ1-42刺激hBMECs最适浓度和时间：用不同浓度Aβ1-42(12.5，25，50，100，200μmol/L)分别处理hBMECs6h，12h，24h，48h，CCK-8法检测hBMECs细胞活性。(3)CCK-8法检测积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后细胞活性影响：将细胞分为阴性对照组，模型组，积雪草苷25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L组，TAK-242组。常规培养细胞hBMECs后，阴性对照组不做处理，模型组采用50μmol/LAβ1-42处理24h，积雪草苷25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，TAK-242组先分别采用25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L浓度的积雪草苷及1μmol/LTAK-242预处理hBMECs12h，再用50μmol/LAβ1-42处理细胞24h，CCK-8法检测细胞活性;(4)Hoechst33258染色检测积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后凋亡影响：将细胞分为阴性对照组，模型组，积雪草苷25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L组，TAK-242组。常规培养细胞hBMECs后，阴性对照组不做处理，模型组采用50μmol/LAβ1-42处理24h，积雪草苷25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，TAK-242组先分别采用25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L浓度的积雪草苷及1μmol/LTAK-242预处理hBMECs12h，再用50μmol/L Aβ1-42处理细胞24h，采用Hoechst33258染色检测细胞凋亡情况;(5)AnnexinⅤ-FITC检测积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后凋亡率影响：将细胞分为阴性对照组，模型组，积雪草苷25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L组，TAK-242组。常规培养细胞hBMECs后，阴性对照组不做处理，模型组采用50μmol/LAβ1-42处理24h，积雪草苷25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，TAK-242组先分别采用25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L浓度的积雪草苷及1μmol/LTAK-242预处理hBMECs12h，再用50μmol/L Aβ1-42处理细胞24h，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率;(6)JC-1染色检测积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后线粒体膜电位影响：将细胞分为阴性对照组，模型组，积雪草苷25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L组，TAK-242组。常规培养细胞hBMECs后，阴性对照组不做处理，模型组采用50μmol/LAβ1-42处理24h，积雪草苷25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，TAK-242组先分别采用25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L浓度的积雪草苷及1μmol/L的TAK-242预处理hBMECs12h，再用50μmol/L Aβ1-42处理细胞24h，JC-1染色后采用荧光显微镜检测细胞线粒体膜电位;(7)Western blot法检测积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后MyD88依赖的TLR4信号通路主要蛋白表达影响：将细胞分为阴性对照组，模型组，积雪草苷25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L组，TAK-242组。常规培养细胞hBMECs后，阴性对照组不做处理，模型组采用50μmol/LAβ1-42处理24h，积雪草苷25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，TAK-242组先分别采用25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L浓度的积雪草苷及1μmol/LTAK-242预处理hBMECs12h，再用50μmol/L Aβ1-42处理细胞24h，采用Western blot检测TLR4，MyD88，TRAF6，p-NF-κB p65，total NF-κB p65蛋白表达情况。　　结果：(1)积雪草苷干预浓度选择：与阴性对照组比较，积雪草苷100μmol/L以下浓度处理不同时间后细胞活性无明显变化，积雪草苷200μmol/L处理细胞24h，48h活力稍下降，但比较无显著差异(p＞0.05)。(2)Aβ1-42刺激hBMECs最适浓度和时间：与阴性对照组比较，Aβ1-4212.5，25μmol/L处理6h，12h，24h,48h,Aβ1-4250,100μmol/L处理hBMECs6h,12h,Aβ1-42200μmol/L处理6h细胞活性无明显变化，比较无显著差异(p＞0.05);Aβ1-4250，100μmol/L处理hBMECs24h，48h，Aβ1-42200μmol/L处理12h，24h，48h细胞活性明显降低，差异有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)。(3)积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后细胞活性影响：与阴性对照组比较，模型组细胞活性明显降低(p＜0.01);与模型组比较，积雪草苷25μmol/L组，50μmol/L组，100μmol/L组和TAK-242组可增加细胞活力，差异有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)。(4)积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后凋亡影响：与阴性对照组比较，模型组出现亮蓝色细胞核比例增加，即凋亡细胞增加，差异有统计学意义(p＜0.05);与模型组比较，积雪草苷各浓度组和TAK-242组凋亡细胞减少，差异有统计学意义(p＜0.05)。(5)积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后凋亡率影响：与阴性对照组比较，模型组细胞凋亡率明显增加，差异有统计学意义(p＜0.05);与模型组比较，积雪草苷各浓度组和TAK-242组细胞凋亡率降低，差异有统计学意义(p＜0.05)。(6)积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后线粒体膜电位影响：与阴性对照组比较，模型组hBMECs细胞膜电位明显降低，差异有统计学意义(p＜0.05);与模型组比较，积雪草苷各浓度组和TAK-242组细胞明显增加由Aβ1-42(50μM)降低的线粒体膜电位，差异有统计学意义(p＜0.01)。(7)积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后TLR4信号通路蛋白表达影响：与阴性对照组比较，模型组TLR4，MyD88，TRAF6，p-NF-κB p65等蛋白表达明显增加，差异有统计学意义(p＜0.01)：与模型组比较，积雪草苷各浓度组和TAK-242组细胞TLR4，MyD88，TRAF6，p-NF-κB p65等蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(p＜0.01)。(8)积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后细胞内NF-κB p65核转移影响：与阴性对照组比较，模型组可明显增加NF-κB p65核转移阳性细胞数，差异有统计学意义(p＜0.01);与模型组比较，积雪草苷各浓度组和TAK-242组NF-κB p65核转移的阳性细胞数减少，差异有统计学意义(p＜0.05)。(9)积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后炎症因子TNF-α及IL-6影响：与阴性对照组比较，模型组显著诱导hBMECs细胞释放炎性因子TNF-α及IL-6，差异有统计学意义(p＜0.05);与模型组比较，积雪草苷各浓度组和TAK-242组细胞TNF-α及IL-6表达水平明显减少，差异有统计学意义(p＜0.01)。　　结论：(1)积雪草苷可以降低Aβ1-42诱导的hBMECs细胞凋亡。(2)积雪草苷可以抑制TLR4/NF-κB信号通路中TLR4，MyD88，TRAF6，p-NF-κB p65蛋白表达，抑制细胞NF-κB核转移，抑制炎性因子TNF-α与IL-6释放。

目录

摘要

前言

2、Aβ诱导炎症反应致脑血管内皮细胞功能障碍可能与TLR4／NF-κB通路有关

3、积雪草苷可能对Aβ诱导的腑微血管内皮细胞凋亡具有保护效应

1 实验材料与仪器

2 主要实验试剂

3 主要实验仪器

4 方法

结果

1 积雪草苷干预浓度选择

2 Aβ1-42刺激hBMECs最适浓度和时间

3 积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后细胞活性影响

4 积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后凋亡影响

5 积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后凋亡率影响

6 积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后线粒体膜电位影响

7 积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后MyD88依赖的TLR4信号通路主要蛋白表达影响

8 积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后细胞内NF-κB p65核转移影响

9 积雪草苷对Aβ1-42刺激hBMECs后炎症因子TNF-α及IL-6影响

讨论

1 细胞的选择

2 积雪草苷干预浓度及时间选择

3 积雪草苷对AB1-42诱导的hBMECs凋亡作用

4 积雪草苷对Aβ1-42诱导的TLR4／NF-κB通路影响

5 积雪草苷对Aβ1-42刺激引起的炎性因子影响

6 本实验不足之处与展望

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

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