DNA去甲基化增强人牙周膜干细胞成骨能力并逆转其在高糖环境下受损的成骨潜能

摘要

第一部分Ⅰ型糖尿病大鼠模型的构建及其牙周膜甲基化水平检测　　目的:建立Ⅰ型糖尿病大鼠模型，检测其牙槽骨骨量变化及牙周膜中DNA甲基化程度。　　方法:30只8周龄雄性SD大鼠，随机分为两组分别注射链脲佐霉素（Streptozotocin，STZ，60mg/kg）和柠檬酸钠(1 mL/kg)。成功建立糖尿病大鼠模型后，分别选取两组中大鼠下颌骨及磨牙、牙周膜等周围邻近组织行microCT检测骨量变化。同时运用免疫组化手段检测糖尿病大鼠牙周膜中5甲基胞嘧啶(5-mC)含量以表征其甲基化程度。　　结果:糖尿病大鼠与对照组大鼠相比牙槽骨骨量明显减少，并且牙周膜中5-mC含量明显增加。　　结论:Ⅰ型糖尿病大鼠模型表现出牙槽骨减少及牙周膜甲基化程度增高的临床表征。　　第二部分体外人牙周膜干细胞的获得和鉴定　　目的:分离及培养人牙周膜干细胞(human periodontal ligamentstem cells，hPDLSCs)，检测其多向分化能力和间充质细胞表征。　　方法:采用12位年龄在14-18周岁临床接受正畸拔牙矫治患者所拔除健康前磨牙，刮取牙周膜组织并采用组织块酶消化法以获得目的细胞。检测其多向分化能力;通过免疫荧光细胞化学染色检测细胞角蛋白(CK14)和波形丝蛋白(Vimentin)以验证其间充质细胞特性;通过流式细胞术(FCM)检测间充质细胞表面抗原以排除造血细胞、单核细胞等混入对试验结果造成影响。　　结果:获得的hPDLSCs能成功诱导出矿化结节、脂滴及神经细胞样突起;Vimentin染色阳性，CK14染色阴性;流式检测没有出现造血或单核等其他来源的细胞。　　结论:经鉴定，分离出的目的细胞具有多向分化能力并为间充质来源的干细胞。　　第三部分 DNA甲基化抑制剂5-aza-dC在高糖环境下对hPDLSCs甲基化程度及成骨分化能力的影响　　目的:明确甲基化抑制剂在高糖环境下对hPDLSCs甲基化程度及成骨向分化能力的影响。　　方法:通过向培养液中加入葡萄糖(30mM)、DNA甲基化抑制剂5-aza-dC(1μM)，将人牙周膜干细胞随机分为四组:高糖组、抑制剂组、高糖加抑制剂组及对照组。在成骨诱导液中分别培养4天后运用实时定量逆转录聚合酶链式反应实验(Real-time RT-PCR)检测高糖组和对照组甲基化相关基因（Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b）变化，并分别于3天和7天提取四组DNA行整体甲基化水平检测。检测四组细胞在成骨诱导液中培养3天及7天时碱性磷酸酶(ALP)活性，茜素红染色检验四组细胞体外培养2周后矿化结节形成状况，提取四组细胞3天和7天时的mRNA和总蛋白，RT-PCR检测成骨分化相关标志基因(ALP、OCN、OPN和OSX)的表达情况，蛋白免疫印迹实验(Western blot)检测骨向分化相关蛋白（ALP、OPN和OSX）的表达情况。　　结果:高糖组Dnmts的表达及DNA整体甲基化程度较对照组明显升高，抑制剂组降低DNA甲基化程度的同时能降低高糖环境下升高的甲基化程度;在成骨诱导条件下，抑制剂组相较于其他三组在ALP活性、矿化结节形成量、成骨向分化标志基因及蛋白表达（ALP、OCN/OCN、OPN/OPN、OSX/OSX）均明显增高，高糖和抑制剂组检测指标次之，高糖组检测指标均最低。　　结论:在高糖环境中，hPDLSCs的甲基化程度升高并伴随着成骨向分化能力的减弱，DNA甲基化抑制剂5-aza-dC能逆转高糖环境下被削弱的成骨潜能。　　第四部分5-aza-dC通过经典Wnt信号通路逆转hPDLSCs在高糖环境下受损的成骨能力　　目的:探讨经典Wnt信号通路参与高糖环境下5-aza-dC调控hPDLSCs成骨分化过程中的机制。　　方法:Western blot分别于3天和7天检测高糖组、抑制剂组、高糖加抑制剂组和对照组中经典Wnt信号通路中胞内信号分子β-catenin(non-p active)和p-GSK-3β以及细胞核转录因Left表达量;加入经典Wnt通路胞外抑制剂DKK1(100ng/ml)，采用Western blot分别于1天和3天检测抑制剂组、DKK1组、高糖组、抑制剂加DKK1组、高糖加抑制剂组、高糖加DKK1组以及高糖加抑制剂及DKK1共处理组成骨向分化标志蛋白(ALP、OPN和OSX)的表达情况。　　结果:高糖组中经典Wnt信号通路相关因子水平表达降低，抑制剂组中相关因子表达升高并可逆转高糖对经典Wnt信号通路的抑制作用，差异具有统计学意义(P＜0.05);加入DKK1后，hPDLSCs成骨向分化标志蛋白表达量降低，DKK1加抑制剂组以及高糖和抑制剂及DKK1组成骨向分化标志蛋白表达量明显降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。　　结论:5-aza-dC通过经典Wnt信号通路逆转hPDLSCs在高糖环境下受损的成骨能力。

目录

摘要

前言

第一部分 Ⅰ型糖尿病大鼠模型的构建及其牙周膜甲基化水平检测

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

结论

第二部分 人牙周膜干细胞的获得和鉴定

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

结论

第三部分 DNA甲基化抑制剂5-aza-dC在高糖环境下对hPDLSCs甲基化程度及成骨分化能力的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

结论

第四部分 5-aza-dC通过经典Wnt信号通路逆转hPDLSCs在高糖环境下受损的成骨能力

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

DNA甲基化对干细胞多向分化的调控及其机制 综述

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