海蛇蛇毒抗炎活性肽Hydrostatin-SN10的靶点专一性及其结构生物学研究

摘要

研究背景:　　海蛇中富含具有药用价值的抗炎活性分子，其作用机理和作用靶点尚不明晰。青环海蛇（Hydrophis cyanocinctus）是分布于中国东南沿海的一种优势蛇种，自古以来就在中国被用作食材和药材，也是被收录入《本草纲目》的17种蛇中的其中一种，其蛇毒毒素中含有许多生物活性蛋白质和多肽，在缓解类风湿关节炎、关节痹痛和自身免疫性炎症疾病中有着良好的功效。由于蛇毒中抗炎活性组分的理化性质比较接近，且有些成分丰度很低，通过传统的色谱技术难以分离获得单一组分的蛇毒来进行结构、功能和机制方面的研究。本课题组前期利用噬菌体展示文库技术，建立了以人肿瘤坏死因子Ⅰ型受体(TNFR1)为靶点淘选海蛇蛇毒抗炎活性成分的方法，获得了22氨基酸的抗炎活性肽Hydrostatin-SN1，通过同源建模、肽链截短并利用细胞模型及LPS诱导的小鼠急性休克模型筛选截短肽，得到了靶点特异性更强的十肽Hydrostatin-SN10。在胶原诱导关节炎(CIA)动物模型和炎症性肠病(IBD)动物模型中，Hydrostatin-SN10都具有显著的抗炎效应，有望研发成为治疗TNF-α受体(TNFRs)相关炎症性疾病的新型靶向特异性海洋多肽类药物。　　TNF-α与两型TNF受体（TNFR1和TNFR2）的相互作用及下游信号通路的异常激活是类风湿关节炎、溃疡性结肠炎等自身免疫性疾病发生发展的重要因素。先导肽Hydrostatin-SN1与TNFR1、TNFR2均有一定的结合能力，并能拮抗TNF-α与TNFR1/TNFR2的相互作用，而Hydrostatin-SN10与TNFR1的亲和力更强，且在细胞水平实验中能够在一定浓度范围内抑制TNFR1介导的下游NF-κB及MAPKs信号通路。但Hydro statin-SN10的靶点专一选择性尚无明确验证，即是否与TNFR2结合、能否竞争性抑制TNF-α与TNFRs的相互作用尚没有进行验证。同时，TNFR1与Hydrostatin-SN10的结合部位、结合模式和相互作用氨基酸亦不明确。因此，验证Hydrostatin-SN10的受体选择性，并探究Hydrostatin-SN1/SN10同TNFR1结合的复合物构象，将为阐明Hydrostatin-SN10特异性拮抗TNFR1发挥抗炎作用的分子机制打下重要的基础。　　研究目的:　　确证Hydrostatin-SN10对靶点TNFR1拮抗作用的专一性，利用结构生物学的方法测定TNFR1-SN10复合物的三维结构，找到多肽与受体的结合位点和关键作用氨基酸，进一步揭示Hydrostatin-SN10选择性拮抗TNFR1的分子机制，为多肽的结构改造以及新型TNFR1选择性抑制剂的研发奠定生物学基础。　　研究方法:　　1、利用多种生物分子相互作用测定技术检测Hydrostatin-SN10分别与TNFR1、TNFR2和TNF-α的相互作用，获得亲和力常数、结合动力学参数和热动力学参数等数据，分析结合方式与性质，并以竞争性结合的方法观察Hydrostatin-SN10是否可以阻断或抑制TNF-α与TNFR1/TNFR2的相互作用。　　2、通过不依赖连接酶的克隆(Ligation-Independent Cloning,LIC)构建人TNFR1胞外区(sTNFR1)蛋白的原核表达载体，在大肠杆菌中表达sTNFR1，摸索合适的诱导表达条件;经过亲和层析、离子交换层析和分子筛层析对目的蛋白进行精细纯化，获得高纯度的sTNFR1蛋白。　　3、等温滴定量热法(ITC)鉴定体外表达的sTNFR1与TNF-α结合的生物学活性;微量差示扫描荧光技术(nanoDSF)筛选目的蛋白稳定性最高的缓冲液条件。　　4、将sTNFR1与多肽Hydrostatin-SN1/SN10共孵育，采用悬滴法进行sTNFR1-SN10复合物共结晶和sTNFR1单晶生长的大规模条件初筛，对部分较好的结晶条件进行优化，培养高质量的蛋白晶体。　　5、使用同位素标记的氮源和碳源在M9培养基中表达和纯化15N、13C标记的sTNFR1蛋白;构建麦芽糖结合蛋白(MBP)和Hydro statin-SN10的融合表达载体，表达纯化15N、13C标记的重组多肽Hydrostatin-SN10。　　6、运用核磁共振技术(NMR)分别测定15N-sTNFR1和15N-SN10的2D1H-15N HSQC波谱，然后加入相应的未标记配体进行二维滴定，分析化学位移情况，验证sTNFR1与Hydrostatin-SN10结合的热点区域(hot spots)氨基酸;将15N、13C双标记的蛋白和多肽孵育，收集NMR波谱数据，解析复合物的溶液三维结构。　　研究结果:　　1、利用表面等离子共振(SPR)、微量热泳动(MST)、和等温滴定量热法(ITC)验证Hydrostatin-SN10的靶点专一性。SPR实验表明，Hydrostatin-SN10能特异性结合TNFR1，而和TNFR2、TNF-α没有特异性结合;Hydrostatin-SN10能够竞争性抑制TNF-α与TNFR1的相互作用，而对TNF-α与TNFR2的结合没有影响。MST结果显示，Hydrostatin-SN10与TNFR1有特异性结合，亲和力KD值（平衡解离常数）为2.83μM;Hydrostatin-SN10与TNFR2和TNF-α没有相互作用。ITC结果表明，Hydrostatin-SN10与TNFR1存在相互作用，亲和力约为2.29μM，与TNFR2、TNF-α没有结合。　　2、成功构建人TNFR1胞外区蛋白的原核表达载体pMCSG7-sTNFR1-161、pMCSG7-sTNFR1-190、pMCSG7-sumo-sTNFR1-161和pMCSG7-sumo-sTNFR1-190。使用LB培养基在大肠杆菌BL21中表达，优化了诱导表达温度、诱导时间和诱导剂浓度。确立了目的蛋白的变性、复性缓冲液体系，通过镍柱亲和层析、阳离子交换层析和凝胶过滤层析分离纯化获得了高纯度(＞97％)的sTNFR1蛋白，其产量约为7.3mg每升菌液。　　3、ITC验证结果表明，体外表达的重组sTNFR1-161、sTNFR1-190蛋白与TNF-α有良好的结合能力，KD值分别为154.8nM和190.1nM，与文献报道水平数量级一致。　　4、nanoDSF确定了目的蛋白用于结晶实验的缓冲液条件:20mM Tris-HCl pH7.5，150mM NaCl，在这个溶液中sTNFR1的Tm值为77.67±0.05℃。使用96孔悬滴板进行结晶条件初步筛选，找到了sTNFR1和TNFR1-SN10复合物的多个结晶条件，对生长较好的条件进行优化，获得了sTNFR1蛋白的高质量晶体(0.2mm×0.2mm×0.1mm)。目前TNFR1-SN10复合物的晶体正在继续优化中。　　5、收集sTNFR1晶体的X射线衍射数据，通过分子置换法解析数据，得到sTNFR1的高分辨率(1.69(A))三维结构，与已报道的TNFR1胞外区晶体结构(PDB编号:1NCF)进行叠合比对后显示二者构象基本一致。　　6、使用M9培养基和15N-NH4Cl、13C-葡萄糖对sTNFR1进行同位素标记并成功表达纯化出了15N-13C-sTNFR1蛋白（纯度＞98％）;构建了MBP-多肽的融合表达载体pMCSG9-SN10，体外表达纯化得到了15N、13C标记的重组多肽SN10，用于NMR实验。　　研究结论:　　本研究一方面证明了青环海蛇蛇毒多肽Hydrostatin-SN10能够专一性结合TNFR1，不与TNFR2或TNF-α结合，并且SN10能够选择性地阻碍TNF-α与TNFR1的相互作用;另一方面获得了多肽SN10与TNFR1复合物的初筛晶体，以及同位素标记的重组蛋白sTNFR1和重组多肽SN10，为进一步的结构生物学探索和SN10抗炎机理的揭示奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 Hydrostatin-SN10的靶点专一性验证

前言

材料与方法

实验结果

讨论

第二章 TNFR1与多肽Hydrostatin-SN10复合物的三维结构探索

前言

材料与方法

实验结果

讨论

全文总结

参考文献

综述

发表论文和工作情况

致谢