咬合异常经由NO造成的线粒体损伤导致大鼠下颌髁突软骨细胞凋亡

摘要

研究目的：　　颞下颌关节紊乱病（temporoman dibular disorder，TMD）是口腔颌面部常见的疾病之一，主要影响颞下颌关节（temporomandibular joint，TMJ）及与之相关的颌面肩颈部肌肉群，主要症状表现为关节弹响，运动障碍及关节区或相关肌肉疼痛等。颞下颌关节炎（temporomandibular joint osteoarthritis，TMJ OA）是TMD的重症表现之一。　　软骨细胞凋亡是骨关节炎（osteoarthritis，OA）的病理表现之一。目前公认的OA的主要原因是异常的应力刺激。我们前期的研究表明给 SD 大鼠施加单侧前牙反(unilateral anterior crossbite，UAC)的异常咬合刺激可诱导髁突软骨发生退行性改变，给体外培养的大鼠髁突原代软骨细胞施加流体剪切应力刺激(flow fluid shear stress，FFSS)可以诱导软骨细胞发生凋亡。　　一氧化氮(nitric oxide, NO)是细胞中一种重要的信号分子，在细胞增殖分化和氧化应激保护中发挥重要作用。然而，过量的NO会抑制软骨基质的合成，导致软骨变性。诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)在病理刺激下产生大量NO可导致线粒体损伤，引发内源性细胞凋亡。本研究旨在探讨TMJ OA中NO的来源及其在异常力刺激下软骨细胞凋亡中的作用。　　研究方法：　　采用我们报道的 SD 大鼠 UAC 动物模型和软骨细胞 FFSS 体外模型。在动物模型中，通过苏木精—伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）和番红O染色法（Saffron O staining，SO）显示髁突软骨形态学变化，实时定量聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）检测软骨合成代谢标志基因Ⅱ型胶原（Type ⅡCollagen，COL2）、蛋白多聚糖（aggrecan），和分解代谢标志基因金属蛋白酶13（Matrix Metalloproteinase 13，MMP13）、聚蛋白多糖酶5（A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs，Adamts5）；PT-PCR和免疫组织化学法（immunohistochemistry，IHC）检测 iNOS的表达水平；末端标记法（Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling, TUNEL）检测凋亡细胞、IHC检测半胱天冬酶-9（caspase-9）和半胱天冬酶-3 （caspase-3）的表达水平来评估髁突软骨的凋亡情况。在体外模型中，评估线粒体损伤，用试剂盒测量NO和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)的产生水平，IHC分别检测细胞色素C (cytochrome C，Cyt C)在线粒体内外的表达水平。在体内和体外模型中均用RT-PCR和IHC分析凋亡相关蛋白如B细胞淋巴瘤-2 (B-cell lymphoma 2，Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、caspase-3和聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶1 (poly-ADP-ribose polymerase 1，PARP1)的表达水平。同时在UAC及FFSS模型中引入iNOS抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯（NΩ-Nitro-L-Arginine Methyl Ester Hydrochloride，L-NAME）重新检测上述指标，测定 L-NAME对软骨细胞凋亡的影响。　　结果:　　数据显示UAC诱导SD大鼠髁突软骨退行性改变，细胞凋亡增多，并刺激caspase-3/-9和iNOS的表达。FFSS上调了大鼠髁突软骨细胞中iNOS、SOD和NO的表达，降低了线粒体膜电位，促进Cyt C进入细胞质，软骨细胞发生凋亡。这些变化都可以被iNOS抑制剂L-NAME逆转。　　结论:　　NO参与并介导了异常咬 刺激造成的下颌髁突软骨线粒体损伤和软骨细胞凋亡。抑制NO的产生可能是一种TMJ OA治疗策略。

目录

声明

缩略词表

前言

研究设计与方法

一、实验动物与分组

二、单侧前牙反（牙合）（UAC）模型的建立

三、TMJ局部药物注射

四、组织标本的制备

五、大鼠髁突原代软骨细胞的提取和培养

六、L-NAME细胞毒性检测的浓度梯度实验

七、流体剪切力（FFSS）刺激实验

(一) FFSS时间梯度实验

(二) 加入L-NAME的FFSS实验

八、软骨细胞线粒体的分离

九、组织化学染色

(一) HE染色

(二) SO染色

(三) 组织形态定量分析方法

十、TUNEL染色

十一、免疫组织化学染色（IHC）

十二、iNOS免疫荧光与TUNEL双重染色染色

十三、线粒体膜电位检测（JC-1染色）

十四、软骨细胞中NO含量检测

十五、软骨细胞中总SOD活性检测

十六、实时定量聚合酶链式反应（RT-PCR）

(一) 提取RNA样本

(二) RNA反转录和RT-PCR

十七、蛋白质印迹（Western Blot）检测

(一) 提取蛋白质样本

(二)蛋白质定量及Western Blot

十八、统计分析

结果

一、UAC造成TMJ软骨细胞凋亡以及iNOS表达升高

二、FFSS诱导线粒体损伤和细胞凋亡，刺激iNOS表达

三、L-NAME在100μmol/L时不具有细胞毒性，且可以显著抑制iNOS表达

四、局部注射L-NAME抑制UAC诱导的iNOS表达并减轻软骨退变

讨论

结论

参考文献

综述:骨关节炎中软骨细胞凋亡研究进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢