无能B细胞免疫耐受状态紊乱参与系统性红斑狼疮发病机制的研究

摘要

目的:　　系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一种多系统累及的慢性自身免疫性疾病。SLE发病的中心环节是自身反应性B细胞激活，生成大量针对细胞核、细胞浆以及其他细胞成分的自身免疫性抗体。无能B细胞是存于外周循环系统中通过克隆无能机制达到免疫耐受状态的具有自身反应性的一群B淋巴细胞，具有发展成为致病性自身反应性B细胞的潜能。以CD19+CD27-IgD+IgM-/low为表面标记的BND细胞是目前公认的无能B细胞标记。文献报道，BND细胞免疫耐受状态的紊乱与类风湿关节炎、1型糖尿病等自身免疫性疾病的发病相关。但是，有关SLE患者的BND细胞研究较少。本研究对SLE患者BND细胞免疫耐受状态进行了检测，并对其免疫耐受状态紊乱的机制进行了探索。　　方法:　　1.利用流式细胞术检测SLE患者和健康对照外周血BND细胞比例，并将患者BND细胞比例与临床指标进行相关性分析;　　2.利用流式细胞术检测SLE患者外周血BND细胞表面CD分子、BCR刺激后钙离子内流水平、BCR刺激后胞内酪氨酸磷酸化升高程度，用以评估SLE患者外周血BND细胞免疫耐受状态;　　3.流式分选SLE患者和健康对照的BND细胞以及CD19+CD27-IgD+IgM+B细胞，并进行转录组测序以了解BND细胞的转录组学特征;　　4.通过SLE患者和HC血浆交叉培养实验、血浆细胞因子差异检测、以及Th1/Th2/Th17细胞因子体外刺激实验明确对BND细胞起调控作用的细胞因子;　　5.通过分析SLE患者血浆IL-4表达水平与临床指标相关性、全基因组关联分析(GWAS)明确IL-4是否与SLE发病相关;　　6.建立无能B细胞体外模型以便进行功能研究;　　7.利用无能B细胞体外模型，探索IL-4对无能B细胞的调控作用;　　8.使用免疫共聚焦显微镜、间接标记流式细胞术、荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹技术探索IL-4对无能B细胞免疫耐受调节的机制。　　结果:　　1.与健康对照相比，SLE患者外周血BND细胞比例降低，且SLE患者外周血BND细胞比例与疾病活动度负相关，糖皮质激素治疗能够上调患者BND细胞比例;　　2.SLE患者外周血BND细胞表面CD80、CD86、CD95和CD71与健康对照无明显差异;BCR刺激后，SLE患者BND细胞的钙离子内流水平和酪氨酸磷酸化升高程度均比健康对照升高，表明其BCR信号通路的应答能力增强，提示SLE患者BND细胞免疫耐受状态紊乱，处于相对活化状态;　　3.转录组测序分析提示，SLE患者的BND细胞在细胞活化、增殖、分化相关基因的表达与健康对照存在差异;功能以及通路分析提示SLE患者的BND细胞在活化、免疫调控、细胞因子-细胞因子受体相互作用等方面与健康对照存在差异;　　4.SLE患者血浆高表达IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ，且只有IL-4能在体外培养时降低外周血BND细胞比例;　　5.SLE患者血浆IL-4表达水平与SLEDAI评分正相关，与补体C3、C4负相关;GWAS分析提示IL-4与SLE疾病相关;　　6.抗CD79b单克隆抗体可以在体外诱导na(i)ve B细胞成为无能B细胞;　　7.IL-4可以上调无能B细胞表面IgM从而逆转无能B细胞免疫耐受状态;　　8.IL-4通过促进内化的IgM再循环到细胞表面以及促进IgM的新合成而上调细胞表面IgM，且这种作用是通过p-STAT6介导的。　　结论:　　本研究明确了SLE患者外周血BND细胞比例降低，且BND细胞比例与SLE疾病活动度相关，是潜在的疾病活动度评价指标。SLE患者BND细胞的BCR信号通路的应答能力高于健康对照，表明SLE的BND细胞的免疫耐受状态紊乱，处于相对活化状态。首次对健康人以及SLE患者的BND细胞进行了转录组学研究，探索了无能相关的基因及通路，为深入探索无能B细胞免疫耐受机制打下了基础。此外，发现SLE患者血浆中高表达的IL-4可以通过上调BND细胞表面IgM的表达，实现对BND细胞免疫耐受状态的逆转。而且IL-4是通过增加p-STAT6的表达而促进内化的IgM再循环到细胞表面以及促进IgM的新合成来逆转无能B细胞免疫耐受状态。研究为SLE的治疗寻找了新的治疗策略，即可以通过诱导外周B细胞无能或者靶向阻断IL-4信号通路来治疗系统性红斑狼疮。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

一、SLE外周血BND细胞比例与疾病活动度相关性分析

二、SLE患者外周血BND细胞功能状态检测

三、SLE患者及健康对照BND细胞和CNB细胞RNA测序

四、血浆交叉培养及细胞因子体外刺激实验

五、IL-4与SLE相关性分析

六、无能B细胞体外模型的建立

七、IL-4逆转无能B细胞免疫耐受状态

八、IL-4逆转无能B细胞免疫耐受状态的机制探索

讨论

全文总结

参考文献

文献综述

在读期间发表论文及参与科研情况

致谢