果蝇ECPW2的克隆、表达、纯化和初步晶体学分析以及DnaB,DnaC的克隆、表达、纯化和结构探究

摘要

1.果蝇ECPW2克隆、表达、纯化以及初步晶体学分析
　　 真核生物翻译过程中需要许多蛋白质因子的参与和调节。果蝇蛋白ECP是一种含有翻译起始因子eIF5C结构域的蛋白质，含有422个氨基酸残基，两个独立折叠的结构域:N端结构域属于经典亮氨酸拉链家族;C端结构域属于含有W2结构域的BZW家族。同源序列比对后，我们发现ECP的W2结构域与许多真核翻译起始因子序列有着较高的序列同源性。同源性较高的有:人源eIF2Bepsilon亚基C端结构域，人源P97C端结构域，eIF4gamma亚基和eIF5。跟据文献报道，ECP可以与酿酒酵母中核糖体相关蛋白dRPL5发生免疫共沉淀，且突变体有着相似的缺失表型。因此我们推测ECP参与了蛋白质的转录起始过程。ECPW2结构域的晶体结构有助于我们了解ECP在细胞内如何行使功能。我们从含有果蝇ECPcDNA的质粒中克隆了ECPW2结构域的CDS序列，构建了ECPW2-p28质粒，并将EcpW2-p28质粒转化到E.coliBL21(DE3)中，经过IPTG诱导，重组蛋白ECPW2在E.coliBL21(DE3)可溶性表达，用Ni亲和柱进行初步纯化。随后对于Ni柱纯化的洗脱液进行浓缩、脱盐以及换盐等一系列条件摸索，发现蛋白在buffer25mMTris-HCl，pH8.0，NaCl盐浓度大于40mM/L的条件下，蛋白质溶液可以稳定存在。通过阴离子交换层析纯化和Superdex200凝胶阻滞层析纯化，我们得到了高纯度的ECPW2蛋白。用悬滴气相扩散法经过初筛和梯度优化以及Addtive晶体优化条件摸索，我们得到了可以用做X-RAY衍射的ECPW2蛋白结晶体。X-Ray衍射数据分析表明晶体衍射分辨率可达到2.70(A)，完成了晶体衍射数据的收集，晶体空间群为I4，晶胞参数为a=b=81.05，c=57.44(A)。一个晶体学不对称单位有一个蛋白质分子。ECPW2与人源翻译起始因子eIF2epsilon亚基有24％的同源性，以人源翻译起始因子eIF2BesilonsubunitC端结构域为结构模型，用Molrep程序运行分子置换求解相位但没有得到合适的解。我们考虑进一步进行硒代蛋白的纯化。目前已经可以得到纯度较高硒代蛋白，蛋白的晶体生长条件仍然在摸索中。
　　 2.E.ColiDnaB、DnaC克隆、表达、纯化和结构探究
　　 E.coli中，DnaB是最主要的负责解旋双链DNA(dsDNA)的酶之一，在复制起始阶段DnaB将双链DNA解旋成单链DNA(ssDNA)。在经典模型中，DnaA结合在OriC附近一段被称作TATA盒的序列，TATA盒会自发轻度解旋。随后DnaA招募了DnaB，在DnaC的协助下，DnaB结合到OriC上，伴随着结合的发生ATP水解DnaC解离。DnaB发挥5’→3'的解旋酶活性，将双链DNA解旋为单链，以便其余蛋白质装配。DNA的复制发生在解旋过后由各种蛋白质分子装配的复制叉中，而且DnaB必须在DnaC、ATP以及Mg2+的存在下才可以与OriC结合。
　　 DnaB有471个氨基酸残基，它的分子量约为52.4kDa，其中N端30位氨基酸到127位氨基酸序列的核磁结构已知。DnaC有255个氨基酸残基，它的分子量约为27.9kDa。关于DnaB与Dna1C结合的结构学信息仍然很少，通过了解DnaB、DnaC的结构信息，有助于进一步研究在复制的过程中，DnaB和DnaC是怎样进行装配的。
　　 我们构建了以下这些质粒:DnaB-p28质粒、DnaC-pET22b质粒、DnaC-p28质粒。将DnaB-p28质粒以及DnaC-p28质粒转化到感受态细胞BL21(DE3)，加入IPTG诱导后重组蛋白His6-DnaB和His6-DnaC都可以可溶性的表达。重组蛋白DnaB和DnaC分别用Ni亲和柱进行初步的纯化，洗脱液在浓缩脱盐时发生了蛋白质变性沉淀。在缓冲溶液中加入Mg2+和ATP，沉淀现象得到了改善，经过疏水层析以及凝胶阻滞层析(Superdex200)得到了纯度较高的蛋白，通过洗脱体积与预测的分子量比较，推测DnaB与DnaC在蛋白溶液中均是以单体形式存在。经过实验室机器人晶体初筛，对有晶体的生长条件进行了梯度优化，但是均没有发现晶体。目前DnaB，DnaC的晶体生长条件仍在摸索中。
　　 我们将DnaB-p28质粒，DnaC-pET22b质粒共转染BL21(DE3)，希望DnaB和DnaC在细胞内共表达，以获得大分子蛋白质的复合物。DnaB，DnaC在E.coliBL21(DE3)中共同表达，同时在bindingbuffer中添加了ATP和Mg2+，经过过Ni亲和柱纯化后，在洗脱液中发生了剧烈的沉淀，得到的可溶性蛋白很少，目前纯化的条件仍然在摸索中。

目录

声明

摘要

第一篇 果蝇ECPW2的克隆、表达、纯化以及初步晶体学分析

第一章 综述-翻译起始因子与果蝇蛋白ECP

1．1 蛋白质的翻译过程

1．2 含有eIF5C结构域的果蝇蛋白ECP

1．3 果蝇ECPW2蛋白的实验进展和目前存在的问题

第二章 实验材料与方法

2．1 质粒的构建和重组蛋白质表达、纯化

2．2 ECPW2的晶体生长和优化

2．3 ECPW2的晶体的衍射，数据处理和初步晶体学分析

第三章 实验结果与讨论

3．1 质粒的构建和蛋白表达、纯化

3．2 ECPW2的晶体生长和优化

3．3 ECPW2晶体的衍射分析和数据处理

3．4 小结

第二篇 DnaB、DnaC的克隆、表达、纯化和结构探究

第四章 综述

4．1 E.coli中DNA的复制

4．2 DnaB的生物学功能

4．3 DnaC与AAA+家族

4．4 DnaC功能探究

4．5 DnaB的结构探究

4．6 DnaB和DnaC的试验进展和研究问题

第五章 实验材料与方法

5．1 质粒的构建和蛋白表达，纯化

5．2 DnaB与DnaC的晶体生长条件摸索

第六章 实验结果与讨论

6．1 质粒的构建和蛋白的表达纯化

6．2 DnaB、DnaC的结晶条件的探索

6．3 小结

参考文献

附录 试剂和溶液

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果