hPRS1的克隆、表达、纯化和初步晶体学分析以及人BART1的克隆、表达、纯化和结构探究

摘要

hPRS1的克隆、表达、纯化以及初步晶体学分析5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)合成酶催化5磷酸核糖(R5P)和三磷酸腺苷酸(ATP)反应生成腺苷酸(AMP)和PRPP，而PRPP是体内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸从头合成(denovosynthesis)途径以及补救合成(或重新利用)(salvagepathway)途径的必须底物和重要的调节物。PRPP合成酶是两类核苷酸合成代谢重要的调节酶。PRPP合成酶存在于所有从原核生物到真核生物细胞内，序列比对显示出彼此之间的较高的同源性，表明了此酶的保守性。人类编码PRPP合成酶的基因(PRPS)编码三种PRPP合成酶：hPRS1、hPRS2和hPRS3。我们从人脑cDNA文库中克隆了hPRS1的CDS序列，并构建了PRPS1-pET-22b质粒。重组蛋白hPRS1-His6在E.coliBL21(DE3)中表达量高，用Ni亲和柱纯化后纯度达到95％以上。蛋白质在浓缩和脱盐过程中一直在沉淀，加入Mg2+和Pi以后沉淀现象更明显，由于Mg2+和Pi是酶的催化作用必须的，推测聚集状态是酶的活性状态。动态光散射试验证实重组蛋白确实存在多聚现象，而且聚集状态和蛋白的均一性是温度相关的。用悬滴气相扩散法经过筛选和优化得到了hPRS1和Mg2+、Pi以及ATP的共结晶体。X-Ray衍射数据分析表明晶体衍射分辨率可达到2.6(A)，完成了晶体衍射数据的收集，晶体空间群为R3，晶胞参数为a=b=168.846(A)，c=61.857(A)。分析计算和自旋patterson函数计算均表明，一个晶体学不对称单位有两个蛋白质分子。以枯草杆菌的PRPP合成酶(1DKR)为结构模型，用分子置换法已获得结构的初相位解析。结构模型的精化过程正在进行中。 人BART1的克隆、表达、纯化和结构探究ARF(ADP-ribosylationfactorARF)家族是Ras致癌基因蛋白GTPase超家族的一枝，包括ARF，Sar(Secretion-associatedandRas-related)以及ARF相似蛋白质ARL。ARF和Sar参与细胞内膜泡的运输，它们的这种功能依赖于GTP的结合并且可逆地与膜结合或分离。ARL蛋白质与ARF以及ARLs之间约有40％-60％的序列相同性，功能却较为分散：ARL1和ARF在结构和功能方面都极为相似；ARL2和ARL3调节微管不同方面的功能，ARL2调节微管蛋白的聚合，ARL3调节胞质分裂和纤毛信号通路；对其他的ARL蛋白质的功能也陆续有报道。ARL蛋白质通过与效应因子的结合而启动一系列的生理功能。由人ARL2BP(NCBINP-036238)基因编码的BART1(BinderofARL2)是ARL2和ARL3的共同的效应因子，BART1与ARL2-GTP能高亲和结合，却不能与ARL2-GDP结合，BART1与ARL2-GTP大部分存在于细胞质中，一部分BART1通过与线粒体内膜蛋白ANT结合而介导了ARL2进入线粒体参与某些功能的调节，一部分BART1和ARL2以及BART1与ARL3还存在于中心体，尽管它们都参与微管的调节，功能却可能不同。BART1是由163个氨基酸残基组成的分子量约为19kDa的小分子蛋白质，对于它的结构和功能还没有太多的研究，对BART1结构信息的了解将有可能进一步了解其与ARL2和ARL3作用的机制，从而对阐明它们参与的生理功能有帮助。 构建的表达质粒ARL2BP-pET22b直接转化到表达菌株E.coliBL21(DE3)，经过IPTG诱导后重组蛋白BART1-HisTag以可溶的形式大量表达，用Ni亲和层析柱纯化就可以得到95％纯度的BART1，凝胶过滤实验和非变性电泳试验证明蛋白质大部分以单体形式存在，少量蛋白质以二聚体形式存在于溶液中。 对表达质粒ARL2BP-pET22b进行改造，得到pGEX-4T-1-ARL2BP表达质粒，并转化到表达菌株E.coliBL21(DE3)。GST-BART1重组蛋白大量表达于上清中。用亲和层析柱GlutathioneSepharose4B纯化蛋白质，并在柱上直接用凝血酶(thrombin)在22℃切12小时，得到纯度为95％的BART1。经过检测发现蛋白质绝大部分以单体形式存在，虽然有极少数的二体，但是与重组蛋白BART1-HisTag比较程度有所减轻。CD光谱试验表明BART1的二级结构以α螺旋为主。BART1的晶体生长条件正在摸索中。

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致谢

摘要

第一篇hPRS1的克隆、表达、纯化以及初步晶体学分析

第二篇人BART1的表达、纯化以及结构探索

附录