鱿鱼足抗氧化与ACE抑制肽的活性研究及在线筛选

摘要

鱿鱼是一种具有高蛋白低脂肪特点的水产品，因此利用鱿鱼制备生物活性肽具有重要的意义。本文选取北太平洋鱿鱼足和阿根廷鱿鱼足，利用酶解技术，超滤分级技术制备具有抗氧化活性和血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性的多肽，并使用凝胶层析柱分离出鱿鱼足的小分子量的多肽，进一步探究北太平洋鱿鱼足多肽和阿根廷鱿鱼足多肽的抗氧化活性和ACE抑制活性。最后使用计算机方法辅助探索北太平洋鱿鱼肌球蛋白中具有抗氧化活性和ACE抑制活性的小分子肽。　　主要研究内容如下:　　(1)鱿鱼足多肽最佳酶解工艺的研究:以水解度(degree of hydrolysis，DH)为指标，选用木瓜蛋白酶作为酶解用酶。通过响应面分析实验发现添酶量，酶解温度和液料比三个因素对响应值均具有显著性影响，得到北太平洋鱿鱼足最佳酶解条件为添酶量1.41％(w/w)，温度51.08℃，液料比2.26∶1(v/v)，酶解6h，DH为30.16±0.31％。阿根廷鱿鱼足的最优参数为添酶量1.43％(w/w)，温度50.86℃，酶解6h，液料比2.06∶1(v/v)，DH为28.98±0.31％。较高DH的鱿鱼足酶解液(squid protein hydrolysate，SPH)为后续实验提供了基础。　　(2)鱿鱼足多肽分离纯化技术的研究:首先测定了北太平洋SPH和阿根廷SPH的DPPH自由基清除率(20.38±0.97％和18.49±0.7％)，羟基自由基清除率(9.35±0.57％和7.75±0.36％)，总抗氧化能力(0.070±0.003U/mL和0.376±0.004U/mL)和ACE抑制能力(45.93±0.31％和42.03±0.19％)用来评价鱿鱼足SPH的抗氧化活性和ACE抑制活性，实验结果显示北太平洋鱿鱼足的抗氧化活性和ACE抑制活性均高于阿根廷鱿鱼足。然后采用超滤分级和Sephadex G-10凝胶层析柱得到SPH-m2对DPPH自由基清除力(DPPH自由基清除率分别为25.86±0.59％和25.95±0.56％)和ACE抑制力(ACE抑制率为75.78±0.63％和75.08±0.71％)最高。经过UPLC测定，确定北太平洋鱿鱼SPH-Ⅲ2和阿根廷鱿鱼足多肽SPH-Ⅲ2的分子量分别为634.84Da和637.2Da。　　(3)计算机模拟产生北太平洋鱿鱼抗氧化肽和ACE抑制肽(angiotensin converting enzyme inhibitory peptide，ACEIP）的研究:使用植物蛋白酶和脯氨酰内肽酶(prolyl oligopeptidase，POP)用于鱿鱼肌球蛋白重链的水解。通过BIOPEP-UWM和ATHpin数据库预测出13种抗氧化肽和126种ACEIP。然后，通过预测毒性，过敏性，胃肠稳定性和肠上皮通透性筛选出2种抗氧化肽和30种ACEIP，其中30种ACEIP包括21种已知肽和9种新肽。此外，通过分子对接评估ACEIP与ACE的相互作用机制。结果表明，ACEIP的新肽中的QY和QM对ACE具有潜在的抑制作用。它们可以通过配位键与Zn(Ⅱ)结合，并通过氢键和疏水相互作用深埋在ACE的疏水口袋S1、S2和S1'中。这项工作表明，北太平洋鱿鱼是抗氧化肽和ACEIP的良好来源，也可以用作在计算机中探索食源性抗氧化肽和ACE抑制肽的方案。

目录

声明

摘要

第一章前言

1．1鱿鱼足的研究背景及意义

1．2生物活性肽

1．2．1抗氧化肽

1．2．2 ACEIP研究现状

1．2．3计算机辅助挖掘生物活性肽的研究现状

第二章鱿鱼足多肽制备的工艺优化

2．1材料与仪器

2．1．1实验材料

2．1．2实验试剂

2．1．3仪器与设备

2．2实验方法

2．2．1鱿鱼足的蛋白质的测定

2．2．2鱿鱼足蛋白的氨基酸测定

2．2．3鱿鱼足的酶解方法

2．2．4水解度的测定

2．2．5单因素实验

2．2．6酶解工艺的优化

2．3结果与讨论

2．3．1鱿鱼足蛋白质含量与氨基酸含量

2．3．2鱿鱼足酶解单因素条件研究

2．3．3响应面酶解条件的研究

2．4本章小结

第三章鱿鱼足抗氧化及ACEIP的分离纯化及活性评价

3．1材料与仪器

3．1．1实验材料

3．1．2实验试剂

3．1．3仪器与设备

3．2实验方法

3．2．1鱿鱼足多肽酶解液氨基酸含量的测定

3．2．2鱿鱼足多肽清除DPPH自由基清除活性的测定

3．2．3鱿鱼足多肽羟基自由基清除能力的测定

3．2．4鱿鱼足多肽总抗氧化能力的测定

3．2．5鱿鱼足多肽ACE抑制活性的测定

3．2．6鱿鱼足多肽的超滤分级

3．2．7 Sephadex G-10凝胶层析柱

3．2．8多肽的分子量测定

3．3结果与讨论

3．3．1鱿鱼足多肽粗提物的氨基酸组成及含量

3．3．2鱿鱼足多肽粗提物DPPH自由基清除效果

3．2．3鱿鱼足多肽粗提物羟基自由基清除效果

3．2．4鱿鱼足多肽粗提物的总抗氧化能力

3．2．5鱿鱼足多肽粗提物ACE抑制效果

3．2．6鱿鱼足多肽多肽分子量分布

3．2．7鱿鱼足超滤分级多肽的DPPH自由基清除效果

3．2．8鱿鱼足超滤分级多肽的ACE抑制效果

3．2．9凝胶层析组分的抗氧化和ACE抑制能力

3．2．10凝胶层析组分的分子量

3．4本章小结

第四章北太平洋鱿鱼中抗氧化肽与ACEIP的计算机在线筛选

4．1材料与方法

4．1．1使用计算机模拟水解北太平洋鱿鱼肌球蛋白

4．1．2预测具有抗氧化活性和ACE抑制活性的多肽

4．1．3计算机预测肽的物理化学性质

4．1．4 ACE与ACEIP的分子对接

4．1．5分子动力学模拟

4．2结果与讨论

4．2．1使用木瓜蛋白酶模拟水解北太平洋鱿鱼肌球蛋白重链

4．2．2北太平洋鱿鱼肌球蛋白重链的计算机水解

4．2．3抗氧化肽与ACEIP的计算机模拟预测

4．2．4抗氧化肽和ACEIP的计算机筛选

4．2．5 ACEIP与ACE的分子间相互作用

4．2．6 ACE与来于北太平洋鱿鱼肌球蛋白重链的QM和QY的分子动力学

4．3本章小结

全文结论

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文及研究成果