双孢蘑菇PPO基因家族的鉴定和部分基因功能分析

摘要

双孢蘑菇(Agaricus bisporus)风味独特、肉质鲜美，并且具有较高的营养价值和药理功效，是目前世界上栽培规模最大、消费量最大的食用菌，也是我国出口创汇最多的食用。双孢蘑菇子实体采后极易发生褐变，导致降鲜菇商品性的降低，困扰着双孢蘑菇产业的发展。据研究，多酚氧化酶(PPO)催化酚类底物聚合成醌类物质形成黑色素是导致双孢蘑菇褐变的重要因素。　　 本研究首先鉴定了双孢蘑菇PPO基因家族，之后对子实体不同发育时期和15℃不同贮藏时间的PPO基因活性进行检测分析，最后构建双孢蘑菇表达载体，研究结果如下：双孢蘑菇基因组鉴定了5个PPO基因家族成员，所用PPO蛋白都含有保守的CuA和CuB功能结构域，并且在整个Cu保守结构中有许多保守的残基。系统进化树分析表明AbPPO1、AbPPO2、AbPPO3与AbPPO5具有较高的同源性，而AbPPO4与巴西蘑菇(Agaricus blazei)，双色蜡蘑(Laccaria bicolor)，香菇(Lentinus edodes)等具有较近的进化关系。半定量RT-PCR分析表明，在双孢蘑菇子实体的不同发育时期，AbPPO1在针头期和纽扣期表达量较低，半茶杯期至大开伞期表达量逐渐升高，大开伞期表达量达到最高。AbPPO2、AbPPO3、AbPPO5在针头期表达量均较低，在茶杯期至大开伞期表达量均较高。AbPPO4在针头期到大开伞期表达量不变，为组成型表达。双孢蘑菇15℃储藏时，AbPPO1在第1天表达量较高，之后至第5天表达量逐渐下降。AbPPO2第4-5天表达均较强，AbPPO3在第1天表达量较高AbPPO5在储藏的第5天表达量最高，AbPPO4在贮藏期间表达量不变。分别将gpd、PPO3启动子置换pCambia1301中的CaMV35S启动子，构建双元表达载体pCghG1和pCghP3，通过农杆菌介导法转入双孢蘑菇菌丝中，实现外源基因在双孢蘑菇中的表达。经过GUS化学组织染色检测，转入pCghG1载体的菌丝染成蓝色，而转入pCghP3载体的菌丝没有变色，说明PPO3属诱导性启动子。

目录

声明

摘要

引言

1 文献综述

1．1 双孢蘑菇概述

1．1．1 双孢蘑菇的食用、药用价值

1．1．2 双孢蘑菇的人工栽培历史

1．1．3 双孢蘑菇褐变的相关研究

1．1．4 双孢蘑菇褐变的抑制研究

1．2 多酚氧化酶概述

1．2．1 多酚氧化酶的分子特征和分布情况

1．2．2 多酚氧化酶的作用机制

1．2．3 多酚氧化酶在分子水平上的研究

1．2．4 植物中的多酚氧化酶

1．2．5 双孢蘑菇多酚氧化酶的研究进展

1．2．6 多酚氧化酶在生物技术方面的应用和展望

1．3 研究目的与意义

2 双孢蘑菇PPO基因家族的鉴定

2．1 材料与方法

2．1．1 数据库的搜索

2．1．2 序列比对及系统发育分析

2．2 结果与分析

2．2．1 双孢蘑菇PPO家族成员的鉴定

2．2．2 双孢蘑菇PPO基因家族系统发育树分析

2．3 小结

3 PPO基因的表达分析

3．1 试验材料

3．1．1 菌株材料

3．1．2 试验试剂

3．1．3 试验仪器

3．1．3 试验所用引物

3．2 方法

3．2．1 双孢蘑菇总RNA的提取纯化

3．2．2 cDNA第一链反转录反应及半定量RT-PCR分析

3．3 结果与分析

3．3．1 PPO基因在子实体不同发育时期的表达情况

3．3．2 PPO基因在15℃不同储藏时间的表达情况

3．4 小结

4 褐变相关PPO基因的功能分析

4．1 试验材料

4．1．1 菌株材料

4．1．2 试验试剂

4．1．3 试验仪器

4．1．4 培养基

4．2 方法

4．2．1 双孢蘑菇高效转化体系的构建

4．2．2 PPO3启动子的转化和表达分析

4．3 结果与分析

4．3．1 双孢蘑菇高效转化体系的构建

4．3．2 表达载体pCghP3的转化和表达

4．4 小结

5 讨论

5．1 PPO与双孢蘑菇的褐变密切相关

5．2 PPO基因的表达在双孢蘑菇褐变中具有重要的作用

5．3 双孢蘑菇高效转化体系的建立

5．4 PPO3启动子为诱导性启动子

参考文献

附录

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致谢