一线抗结核药物诱导小鼠肝损伤对肝细胞NF-κB表达的影响

摘要

目的：研究三种一线抗结核药物（异烟肼、利福平、吡嗪酰胺）诱导小鼠肝损伤发生过程中NF-κB、IκB、TNF-α在肝组织中的表达情况，旨在揭示NF-κB在不同抗结核药物致肝损伤发生发展过程中的变化，对阐明不同抗结核药物性肝损伤发生机制具有重要价值。　　方法：SPF级昆明小鼠168只，适应性喂养一周后将所有动物随机分为四个实验组和一个基线组，实验组分别为异烟肼组(异烟肼90mg/Kg.d)、利福平组(利福平135mg/Kg.d)、吡嗪酰胺组(吡嗪酰胺315mg/Kg.d)、三药联合组（异烟肼+利福平+吡嗪酰胺90mg/Kg.d+135mg/Kg.d+315mg/Kg.d)。再将各实验组随机分成5组，为3d、5d、7d、10d、15d组，每组8只，分别在灌胃3d、5d、7d、10d、15d后处死。基线组8只鼠，在开始灌胃之前一天处死。采用摘眼球取血法收集小鼠血液，颈椎脱臼法处死小鼠取肝组织。全自动生化检测仪检测血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）含量；比色法检测肝组织中丙二醛（MDA）含量和SOD酶活力；SYBR Green实时荧光定量RT-PCR法检测肝组织中NF-κB、IκB和TNF-αmRNA表达水平；酶联免疫吸附法（ELISA）检测肝组织中NF-κB、IκB和TNF-α蛋白含量。所有数据以均数±标准差（(x)±s）表示，时间与处理因素的效应分析采用两因素析因设计方差分析；单独效应分析时，多样本均数的比较均采用Brown-Forsythe法，Dunnett's T3方法进行组间两两比较；相关性分析采用Spearman相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。　　结果：肝组织病理学观察和常用肝功能指标检测结果显示：用药3d后的组织切片即见病理改变，各用药组小鼠血清ALT和AST水平显著上升，提示造模成功。与基线组相比，各用药组小鼠肝组织MDA含量逐渐升高，而SOD活力却逐渐下降，两者呈负相关关系；进一步对NF-κB及其活性抑制因子IκB和炎症相关因子TNF-α的mRNA及蛋白表达情况的分析发现，NF-κB、IκB和TNF-α三项指标mRNA的相对表达量变化与其对应的蛋白表达也呈现出明显的对应关系。随着用药时间延长，各组NF-κB及TNF-α的mRNA和蛋白表达变化趋势一致，对小鼠肝组织NF-κB及TNF-αmRNA和蛋白表达进行析因方差分析，不同用药组间NF-κB及TNF-αmRNA和蛋白表达存在差异（NF-κB：F=3.110，P=0.028；F=18.551，P＜0.001。TNF-α：F=8.655，P＜0.001；F=8.218，P=0.004），不同时间点NF-κB及TNF-αmRNA和蛋白表达差别有统计学意义（NF-κB：F=4.944，P＜0.001；F=5.920，P＜0.001。TNF-α：F=6.171，P＜0.001；F=11.807，P＜0.001），时间与组间存在交互效应（NF-κB：F=1.744，P=0.047；F=4.596，P＜0.001。TNF-α：F=2.756，P=0.001；F=4.495，P＜0.001）。进而对各组各时间点单独效应分析发现，随灌胃时间的延长异烟肼组NF-κB、TNF-αmRNA和蛋白表达逐渐升高，而利福平组、吡嗪酰胺组和三药联合组出现先升高后降低的趋势，7d、10d和15d时各用药组NF-κB蛋白表达差异有统计学意义（F=7.840，P=0.003；F=17.746，P＜0.001；F=54.020，P＜0.001），异烟肼、利福平和吡嗪酰胺组的各时间点间差异也有统计学意义（F=2.955，P=0.028；F=7.918，P＜0.001；F=8.793，P＜0.001）。7d、10d和15d时各用药组 TNF-α蛋白表达差异有统计学意义（F=3.630，P=0.029；F=10.773，P＜0.001；F=16.230，P＜0.001），各用药组的各时间点间差异也有统计学意义（F=7.334，P＜0.001；F=9.095，P＜0.001；F=3.250，P=0.019；F=6.763，P＜0.001）；但是，各组IκB mRNA和蛋白表达与前两者趋势相反，对小鼠肝组织IκB mRNA表达进行析因方差分析，不同用药组间IκB mRNA表达存在差异（F=2.797，P=0.042），不同时间点IκB mRNA表达差别有统计学意义（F=3.982，P=0.002），时间与组间不存在交互效应（F=1.702，P=0.055）。进行单独效应分析，结果表明15d时各用药组IκB mRNA表达差异有统计学意义（F=3.766，P=0.026）。　　结论：异烟肼导致的肝损伤发生过程中，NF-κB通路被激活，其抑制蛋白IκB下调，促炎性因子TNF-α过量产生；而利福平和吡嗪酰胺这两种药物，本身具有的免疫调节作用会使NF-κB通路的激活受到抑制，三药联合组NF-κB活化的结果可能综合了异烟肼的促进作用及利福平和吡嗪酰胺的抑制作用所致。

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引言

第1章 一线抗结核药物诱导小鼠肝损伤对肝细胞NF-κB表达的影响

1.1 材料与方法

1.1.1 主要材料

1.1.2 动物的选择及分组

1.1.3 小鼠一般情况观察及标本采集

1.1.4 小鼠肝组织病理形态学观察

1.1.5 小鼠血清ALT、AST水平测定

1.1.6 小鼠肝组织丙二醛含量、超氧化物歧化酶活力的测定

1.1.7 小鼠肝组织NF-κB、IκB、TNF-αmRNA的表达水平分析

1.1.8 小鼠肝组织NF-κB、IκB、TNF-α蛋白的表达水平检测

1.1.9 统计学分析

1.2 结果

1.2.1 实验动物一般情况

1.2.2 肝组织病理学检查

1.2.3 血清中ALT、AST水平分析

1.2.4 肝组织中MDA含量、SOD酶活力分析

1.2.5肝组织中NF-κB mRNA及蛋白表达情况

1.2.6 肝组织中IκB mRNA及蛋白表达情况

1.2.7 肝组织中TNF-αmRNA及蛋白表达情况

1.2.8 NF-κB与氧化损伤指标（MDA、SOD）和其相关因子IκB、TNF-α的相关性分析

1.3 讨论

1.3.1 三种一线抗结核药物对小鼠造成的肝损伤

1.3.2 一线抗结核药物导致的肝损伤过程中肝组织氧化损伤的情况

1.3.3 肝组织中NF-κB、IκB mRNA及蛋白表达情况

1.3.4 肝组织中TNF-αmRNA及蛋白表达情况

1.4 小结

参考文献

第2章 综 述:NF-κB通路的组成及其调控机制

2.1 NF-κB通路的基本结构

2.2 NF-κB通路及其活化

2.2.1 NF-κB信号通路

2.2.2 NF-κB的活化

2.3 NF-κB信号通路的调控

2.4 TNF-α

2.5 NF-κB与疾病

参考文献

结论

致谢

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