调控miR-148a基因表达及5-Aza-dc处理对水牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳相关基因表达的影响

摘要

MicroRNAs(miRANs)是一类重要的转录后调控的非编码小RNA分子，具有重要的生理调控功能。本课题组之前的研究发现，miR-148a在泌乳期和非泌乳期水牛乳腺组织中的表达有显著差异，且证明其靶基因为DNMT1，表明甲基化表观遗传修饰可能与乳腺的生理功能调控有关。为进一步了解甲基化修饰对乳腺上皮细胞功能状态的调控作用，本研究探讨了miR-148a和甲基化转移酶抑制剂5-Aza-dc对水牛乳腺上皮细胞增殖及其泌乳相关基因表达的影响，取得如下研究结果。　　1.水牛乳腺上皮细胞的原代培养及鉴定。采用泌乳期的水牛乳腺组织块进行乳腺上皮细胞培养，并用胰酶消化差异法分离纯化水牛乳腺上皮细胞。采用免疫荧光、细胞核型分析、油红O染色对其鉴定，绘制生长曲线。结果显示，组织块培养法可成功获得水牛乳腺上皮细胞，纯化的乳腺细胞具有典型上皮细胞的形态特征，具有分泌乳脂的能力，能在体外传代培养20代。　　2.调控miR-148a基因表达对水牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳相关基因表达的影响。(1)为筛选miR-148a对水牛乳腺上皮细胞的合适处理浓度，通过非脂质体法分别转染miR-148a模拟物和抑制剂到乳腺上皮细胞，48h后收集细胞，采用qRT-PCR检测靶基因DNMT1的表达。结果显示，在miR-148a过表达组中，DNMT1的表达随着模拟物浓度的增大而逐渐降低，与阴性对照组相比，50nM miR-148a模拟物可以显著降低DNMT1的表达(P＜0.05);在miR-148a抑制组中，DNMT1的表达随着抑制剂浓度的增大而逐渐升高，与阴性对照组相比，30nM miR-148a抑制剂可以显著提高DNMT1的表达（P＜0.05）。(2)采用50nM miR-148a模拟物和30nMmiR-148a抑制剂分别处理水牛乳腺上皮细胞48h，检测其对细胞增殖和细胞周期的影响及对细胞周期蛋白CyclinD1及mTOR、PparG、Srebp1等泌乳相关基因表达的影响。结果发现，与阴性对照组相比，过表达miR-148a可以显著提高水牛乳腺上皮细胞的活力（P＜0.05）、增加有丝分裂S期细胞的比例、提高CyclinD1基因和泌乳关键基因PparG、Srebp1、Fabp3的表达(P＜0.05);抑制miR-148a表达可以显著降低水牛乳腺上皮细胞的活力(P＜0.05)、增加有丝分裂G1期细胞的比例，降低S、G2期细胞的比例、CyclinD1、Srebp1、Glut1和Fabp3基因的表达显著降低(P＜0.05)。　　3.5-Aza-dc处理对水牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳相关基因表达的影响。(1)为筛选5-Aza-dc处理水牛乳腺上皮细胞的合适浓度，在细胞培养液中分别添加0.1μM/L、0.5μM/L、1μM/L、5μM/L的5-Aza-dc，72h后收集细胞，采用qRT-PCR检测DNMT1基因的表达。结果显示，与空白组相比，添加0.5μM/L、1μM/L、5μM/L5-Aza-dc组中，DNMT1基因的表达量均显著降低(P＜0.05)，故选择低浓度0.5μM/L5-Aza-dc进行后续试验。(2)以0.5μM/L5-Aza-dc处理乳腺细胞72h，采用CCK8试剂盒检测其对细胞增殖、流式细胞仪检测其对细胞周期的影响;qRT-PCR技术检测其对细胞周期蛋白CyclinD1、miR-148a基因及mTOR、PparG、Srebp1等泌乳相关基因表达的影响。结果显示，与空白组相比，添加0.5μM/L5-Aza-dc可以提高水牛乳腺上皮细胞的活力，增加有丝分裂S期细胞的比例，显著提高CyclinD1、miR-148a、Srebp1、Csnls1、Fabp3、Elf5基因的表达(P＜0.05)。　　以上结果表明:miR-148a及DNA甲基化参与水牛乳腺上皮细胞的增殖及调控泌乳相关基因的表达，两者与乳腺发育和泌乳密切相关。

目录

声明

摘要

缩略词

第一部分 文献综述

综述

1 miRNA在乳腺发育及泌乳中的研究进展

2 DNA甲基化及其在乳腺中的研究进展

3 哺乳动物乳腺上皮细胞体外培养的研究进展

研究目的与意义

第二部分 试验部分

第一章 水牛乳腺上皮细胞的原代培养及鉴定

1 材料与方法

2 实验结果

3 分析与讨论

4 小结

第二章 调控miR-148a基因表达对水牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳相关重要基因表达的影响

1 材料与方法

2 实验结果

3 分析与讨论

4 小结

第三章 5-Aza-dc处理对水牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳相关重要基因表达的影响

1 材料与方法

2 结果

3 分析与讨论

4 小结

全文结论

参考文献

致谢

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