金黄色葡萄球菌RsmA蛋白以及酿酒酵母ISW2染色体重塑复合物的结构初探

摘要

本文从以下几部分进行论述：
　　1.金黄色葡萄球菌RsmA蛋白的初步晶体学研究
　　金黄色葡萄球菌是一种重要的致病菌，是人类化脓感染中最常见的病原菌，能够引起局部化脓感染。抑制金黄色葡萄球菌感染的一种方式是抑制其相关毒性蛋白及毒性分子的表达。
　　RsmA蛋白是金黄色葡萄球菌中的一种16S rRNA小亚基甲基转移酶，负责将16S rRNA3'端第一个发卡结构区两个连续的腺嘌呤进行甲基化，并且能够使每个腺嘌呤第6位的氮原子发生一个双甲基化反应。研究发现RsmA蛋白的缺失会影响30S小亚基的生物合成，进而影响到蛋白质的相关翻译过程。
　　对于该部分研究试图通过结构生物学的方法探究RsmA蛋白催化腺嘌呤发生双甲基化的结构基础，通过结构分析找到RsmA上潜在的靶向小分子药物位点，通过设计药物来抑制金黄色葡萄球菌感染。于是我们进行了RsmA蛋白的克隆、表达、纯化并对Native和SeMet-RsmA蛋白进行了晶体生长，收到了一套3.2(A)的数据，通过数据处理了解了RsmA蛋白的一些初步晶体学数据，通过ITC实验检测了RsmA对SAM和SAH的结合，并进行了RsmA与SAM和SAH的共结晶，通过晶体筛选获得了复合物的晶体，但质量并不高有待进一步优化。
　　2.酿酒酵母中的ISW2染色体重塑复合物的结构探索
　　真核生物体内，染色质以核小体的形式存在，这种包装结构非常紧密，使得转录调控蛋白不能结合到DNA上，影响基因的表达。ATP依赖的染色体重塑复合物可以利用ATP水解释放的能量对核小体进行移动，组装，替换，进而导致细胞中染色质的结构发生改变，对基因的表达情况起到调控作用。在酿酒酵母中存在一种保守的ATP依赖的染色体重塑复合物ISWI家族，包含有ISW1和ISW2两种主要的重塑复合物。其中ISW2染色体重塑复合物含有Isw2、Itc1、Opb4和Dls1四个组分，该复合物可以调控核小体串联的间隔，发挥重塑功能。相比于ISW1，ISW2蛋白在发生重塑过程中对于核小体间的链接DNA的长度是没有要求的，并且对于核小体的结构不会起到破坏作用。
　　对于这部分工作，尝试通过解析该复合物及其各组分的结构来探究其重塑的机理。我们对于ISW2各个组分进行了克隆、表达、纯化并进行了晶体生长，获得了Isw2单体的晶体。通过EMSA实验和pull-down实验探究了Isw2和Dpb4+Dls1对于双链DNA的结合能力以及Isw2与Dpb4+Dls1相互作用的片段，尝试了Isw2、Dpb4+Dls1+dsDNA和Isw2片段+Dpb4+Dls1的共晶。与此同时对得到的晶体进行了优化以及衍射数据的收集，希望得到结构信息。

目录

声明

摘要

第一篇 金黄色葡萄球菌RsmA蛋白的初步晶体学研究

第一章：研究背景概述

1．1 基本背景知识简介

1．2 rRNA的甲基化修饰及甲基转移酶简介

1．3 研究目的与研究意义

第二章 实验材料及方法

2．1 金黄色葡萄球菌RsmA的基因克隆及重组质粒的构建

2．2 RsmA的表达纯化及结晶

第三章 实验结果与讨论

3．1 RsmA基因的克隆及质粒构建

3．2 RsmA及其截短蛋白的表达纯化

3．3 RsmA蛋白的晶体生长

本篇小结

参考文献

第二篇 酿酒酵母中的ISW2染色体重塑复合物的结构探索

第一章 研究背景简介

1．1 真核生物的染色质与核小体简介

1．2 真核生物基因转录与染色体重塑

1．3 ATP依赖的染色体重塑复合物

1．4 ISWI染色体重塑复合物以及酿酒酵母中的ISWI染色体重塑复合物

1．5 酿酒酵母中ISW2复合物

1．6 研究意义

第二章 实验材料及方法

2．1 相关蛋白的基因克隆及质粒的构建

2．2 重组蛋白的表达与纯化

2．3 ISW2复合物native蛋白的晶体生长

2．4 Isw2、Dpb4+DIs1与DNA结合的ESMA实验

2．5 Isw2与Dbp4+DIs1相互作用探究

2．6 Isw2，Dpb4+Dls1与dsDNA的共结晶

2．7 晶体的衍射数据收集

第三章 实验结果及分析

3．1 ISW2复合物蛋白及其片段的基因克隆及重组质粒的构建

3．2 重组蛋白的纯化

3．3 重组native蛋白的晶体生长及衍射

3．4 重组蛋白与DNA结合的ESMA实验

3．5 重组蛋白与DHA的共结晶

3．6 Isw2与Dpb4+DIs1相互作用的探究

本篇小结

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文