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摘要
第一章 绪论
1.1 癌症概述
1.1.1 癌症的概念
1.1.2 癌症的症状
1.1.3 癌症的生物学特征
1.1.4 癌症的诱因
1.1.5 癌症的治疗
1.2 乳腺癌概述
1.2.1 乳腺癌的特征
1.2.2 导致乳腺癌的风险因素
1.2.3 乳腺癌的诊断
1.2.4 乳腺癌的分型
1.2.5 乳腺癌的预防
1.2.6 乳腺癌的治疗
1.3 乳腺癌他莫昔芬抗性概述
1.3.1 他莫昔芬简介
1.3.2 雌激素受体的作用机制
1.3.4 他莫昔芬抗性的分子机制
1.4 microRNA概述
1.4.1 microRNA的生成
1.4.2 RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex)
1.4.3 microRNA的细胞功能
1.4.4 microRNA的检测与操控(detection and manipulation)
1.4.5 microRNA导致的疾病
1.5 本章小结
第二章 miR-1254及CCAR1在乳腺癌中表达下调
2.1 人10号染色体长臂miRNA基因不稳定性筛查
2.2 miR-1254与CCAR1共享启动子
2.3 miR-1254与CCAR1在乳腺癌临床样本中表达下调
2.4 miR-1254与CCAR1在乳腺癌细胞中表达下调
2.5 本章小结
第三章 miR-1254与CCAR1在转录后水平相互稳定
3.1 miR-1254 sponge的构建
3.2 miR-1254在转录后水平稳定CCAR1
3.3 miR-1254通过与CCAR1 5’UTR结合而稳定CCAR1
3.4 CCAR1 5’UTR在转录后水平稳定miR-1254
3.5 本章小结
第四章 miR-1254与CCAR1相互稳定的分子基础
4.1 miR-1254与CCAR1的相互稳定依赖于AG02
4.2 miR-1254与CCAR1的相互稳定依赖于局部二级结构
4.3 miR-1254对CCAR1的稳定依赖于局部二级结构
4.4 本章小结
第五章 miR-1254抑制乳腺癌细胞增殖
5.1 miR-1254抑制乳腺癌细胞增殖
5.2 miR-1254抑制乳腺癌细胞分裂
5.3 miR-1254促进乳腺癌细胞凋亡
5.4 本章小结
第六章 miR-1254抑制乳腺癌转移和干细胞样行为
6.1 miR-1254抑制乳腺癌细胞转移
6.2 miR-1254抑制乳腺癌细胞干细胞样行为
6.3 本章小结
第七章 miR-1254恢复乳腺癌他莫昔芬敏感性
7.1 抑制miR-1254可以降低ER+乳腺癌细胞雌激素依赖性
7.2 抑制miR-1254使ER+细胞产生他莫昔芬抗药性
7.3 过表达miR-1254可以恢复他莫昔芬敏感性
7.4 本章小结
第八章 CCAR1 5’UTR恢复乳腺癌他莫昔芬敏感性
8.1 CCAR1 5’UTR恢复他莫昔芬敏感性
8.2 本章小结
第九章 miR-1254通过3’UTR直接调控的基因
9.1 生物信息学预测miR-1254靶点
9.2 双荧光素酶报告实验验证靶点
9.3 免疫印迹实验验证靶点
9.4 免疫组织化学实验验证靶点
9.5 本章小结
第十章 CCAR1与miR-1254靶基因的相互作用
10.1 CCAR1 5’UTR可以下调miR-1254的靶基因
10.2 miR-1254靶基因下调CCAR1
10.3 本章小结
第十一章 总结与讨论
第十二章 材料与方法
12.1 乳腺癌临床冷冻组织中抽提miRNA
12.1.1 乳腺癌病人临床冷冻组织样本
12.1.2 实验试剂及仪器
12.1.3 冷冻组织样本中miRNA的抽提
12.2 miRNA的反转录
12.2.1 实验试剂及仪器
12.2.2 RT-PCR实验步骤
12.3 miRNA的quantitive Real-time PCR(qRT-PCR)
12.3.1 实验试剂及仪器
12.3.2 qRT-PCR实验步骤
12.4 细胞内总RNA提取
12.4.1 实验试剂及仪器
12.4.2 TRIZOL法提取RNA实验步骤
12.4.3 Ambion公司的miRNA抽提试剂盒抽取总RNA实验步骤
12.5 总RNA的反转录
12.5.1 实验试剂及仪器
12.5.2 RT-PCR实验步骤
12.6 总RNA的quantitive Real-time PCR(qRT-PCR)
12.6.1 实验试剂及仪器
12.6.2 qRT-PCR实验步骤
12.7 双荧光报告实验
12.7.1 实验试剂及仪器
12.7.2 双荧光报告实验的原理
12.7.3 双荧光素酶报告载体的构建
12.8 载体的定点突变
12.8.1 实验试剂及仪器
12.8.2 实验步骤
12.9 shRNA载体构建
12.10 其它载体的构建
12.11 质粒中抽
12.12 细胞培养
12.12.1 实验试剂及仪器
12.12.2 细胞日常培养
12.12.3 细胞的冻存与复苏
12.12.4 他莫昔芬抗性细胞系的构建
12.13 细胞的种板和转染
12.13.1 实验试剂及仪器
12.13.2 细胞的种板
12.13.3 细胞的转染步骤
12.14 MTT(细胞活力测定法)
12.14.1 实验原理
12.14.2 实验试剂及仪器
12.14.3 实验步骤
12.15 软琼脂克隆形成实验(Soft Agar)
12.15.1 实验试剂及仪器
12.15.2 实验步骤
12.16 细胞二维(2D)基质胶(matrigel)培养
12.16.1 实验原理
12.16.2 实验试剂及仪器
12.16.3 实验步骤
12.17 细胞克隆形成实验
12.17.1 实验原理
12.17.2 实验试剂及仪器
12.17.3 实验步骤
12.18 细胞单层培养克隆形成实验(monolayer culture)
12.18.1 实验原理
12.18.2 实验试剂及仪器
12.18.3 实验步骤
12.19 细胞球囊悬浮培养(mammospheric growth)
12.19.1 实验原理
12.19.2 实验试剂及仪器
12.19.3 实验步骤
12.20 细胞迁移(Transwell Assay-Migration)实验
12.20.1 实验原理
12.20.2 实验试剂及仪器
12.20.3 实验步骤
12.21 流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)
12.21.1 实验原理
12.21.2 实验试剂及仪器
12.21.3 实验步骤
12.22 蛋白印记法(western blot)
12.22.1 实验试剂及仪器
12.22.2 实验步骤
12.23 稳转细胞系的构建
12.23.1 实验试剂及仪器
12.23.2 实验步骤
12.24 裸鼠体内荷瘤实验
12.24.1 实验试剂及仪器
12.24.2 实验步骤
12.25 免疫组织化学IHC
12.25.1 实验试剂及仪器
12.25.2 实验步骤
12.26 苏木精—伊红染色法(HE染色)
12.27 脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(TUNEL)
12.27.1 实验试剂及仪器
12.27.2 实验步骤
12.28 生物信息学的统计分析
12.29 亲和纯化与miR-1254相结合的mRNA
12.30 亲和纯化与C5U结合的miRNA
附表
参考文献
致谢
在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果