肝癌干细胞相关基因和长链非编码RNA调控自我更新的分子机制研究

摘要

原发性肝癌是全球五大常见癌症之一，中国每年有超过46万新发病例和42万死亡患者，肝癌被称为我国的“国病”，严重威胁着人们的健康水平。肿瘤干细胞学说认为在肿瘤组织中，只有极少量的致瘤性细胞亚群具有无限增生的潜能，具有自我更新和多向分化能力，产生异质性肿瘤细胞，且对化疗药物有耐药性。肿瘤干细胞在启始肿瘤形成和生长中起着关键作用，目前的治疗措施还无法针对肿瘤干细胞发挥作用，这可能是导致多种肿瘤复发、转移和耐药的主要原因。因此，若要治愈肿瘤，必须清除肿瘤中的干细胞。但是肝癌干细胞的自我更新机制仍需进一步阐明。
　　前期研究发现，CD133和CD13两个分子的联合应用能够分选出干性能力更强的肝癌干细胞。分选出肝癌干细胞(CD133+CD13+)和非干细胞(CD133-CD13-)，做转录组芯片分析，鉴定了在肿瘤干细胞中起重要调节作用的基因（C8orf4和Zic2）与长链非编码RNA(Lnc-β-Catm和LncBrm)，并系统研究了它们对肝癌干细胞自我更新的调控作用及其分子机制。
　　转录组分析和临床样本验证均显示C8orf4在肝癌和肝癌干细胞中低表达。C8orf4敲低之后，肝癌干细胞的小球形成能力和肿瘤起始能力削弱。进一步研究发现，C8orf4负调控Notch信号，并得到了临床数据的支持。通过酵母双杂交筛选，发现C8orf4与N2ICD（Notch2胞内段）有相互作用，实验证实C8orf4影响N2ICD的入核而N2ICD的入核对Notch2信号的活化至关重要。进一步研究表明，Notch2本身及其下游基因Nrarp、 Hey1等在肝癌干细胞中也起着非常重要的作用，Notch2、Nrarp和Hey1敲低的细胞有较低的小球形成能力和肿瘤起始能力。还发现Notch靶基因的表达量和肝癌患者的临床分期分级、临床严重性和预后有关。
　　Zic2在肝癌中高表达，在肝癌干细胞中表达量更高。研究表明Zic2敲除的细胞形成小球能力和肿瘤起始能力变弱，Zic2高表达的细胞干性增强。检测发现，Zic2敲除的细胞中OCT4及其下游基因表达量变低，而Zic2高表达的细胞中OCT4表达量升高，证实Zic2能够影响OCT4的表达。酵母双杂交的结果显示，Zic2能够结合NURF复合物，而NURF复合物对于OCT4启动子区的染色体开放和启动转录至关重要。总之，Zic2通过招募NURF复合物，启动OCT4的表达，继而参与肝癌干细胞自我更新的维持。
　　长链非编码RNA(lncRNA)是一类重要的调节分子，在基因表达和其它多种生物学过程中发挥重要作用。我们发现，Lnc-β-Catm分布于细胞核中，调节肝癌干细胞的小球形成能力和肿瘤起始能力。Lnc-β-Catm敲低的细胞干性削弱，而高表达Lnc-β-Catm的细胞干性增强。进一步研究发现，Lnc-β-Catm影响Wnt/β-catenin信号通路。Lnc-β-Catm能够结合β-catenin和EZH2，EZH2能够甲基化β-catenin，甲基化的β-catenin稳定性增加。通过临床样本的检测，发现Lnc-β-Catm的表达量和Wnt/β-catenin的活性与肝癌的严重程度和预后相关。综上所述，Lnc-β-Catm能够促进β-catenin和EZH2的相互作用，进而促进β-catenin的甲基化，增强了β-catenin的稳定性，从而活化了Wnt/β-catenin信号通路，在肝癌干细胞自我更新维持中发挥重要作用。
　　还发现，LncBrm在肝癌干细胞中高表达并促进其自我更新。LncBrm敲低的细胞中，Yap1信号通路受到抑制，而LncBrm高表达则促进Yap1的活化。进一步研究发现，LncBrm与Brm相互作用，并抑制Brm类型的SWI/SNF复合物的组装，促进Brg1类型的SWI/SNF复合物的组装。Brg1类型的复合物能够通过招募Klf4结合到Yap1的启动子区域，启动Yap1的表达，Yap1信号在促进了肝癌干细胞自我更新的维持。
　　总之，鉴定了在肿瘤干细胞中起重要调节作用的基因（C8orf4和Zic2）与lncRNA(Lnc-β-Catm和LncBrm)，确定了它们对肝癌干细胞自我更新的影响及其揭示了其调控自我更新的分子机制。

目录

声明

摘要

第一部分 C8orf4调控肝癌干细胞分子机制研究

第一章 文献综述

1．1 C8orf4结构和功能概述

1．2 肝癌及肝癌干细胞

1．3 Notch信号

第二章 实验材料和方法

2．1 细胞系及其培养条件

2．2 抗体及试剂

2．3 C8orf4 KO细胞系的制备

2．4 C8orf4敲低和高表细胞系及原代细胞的制备

2．5 RNA抽提、RT-PCR和Realtime PCR

2．6 酵母双杂交

2．7 western blot

2．8 免疫荧光

2．9 免疫组化

2．10 核质分离

2．11 小球形成

2．12 Side population分选

2．13 流式细胞术

2．14 IP和co-IP

2．15 肿瘤生长和梯度稀释成瘤

2．17 组学分析和数据挖掘

第三章 实验结果及讨论

3．1 C8orf4在肝癌中低表达

3．2 C8orf4在肝癌干细胞中低表达

3．3 C8orf4负调控肝癌干细胞

3．4 C8orf4负调控Notch信号

3．5 C8orf4与Notch2相互作用，并影响其入核

3．6 Notch2及其下游信号在肝癌干细胞中发挥重要作用

3．7 Notch信号与肝癌临床有密切关系

第四章 讨论与小结

第二部分 Zic2调节肝癌干细胞分子机制研究

第一章 文献综述

1．1 Zic2结构和功能概述

1．2 NURF复合物

1．3 Oct4

第二章 实验材料和方法

2．1 细胞系及其培养条件

2．2 抗体及试剂

2．3 KO和KD细胞系的制备

2．4 Luciferase

2．5 ChIP实验

2．6 EMSA

2．7 DNase Ⅰ敏感性实验

第三章 实验结果及讨论

3．1 Zic2在肝癌中高表达

3．2 Zic2在肝癌干细胞中高表达

3．3 Zic2对肝癌干细胞的自我更新至关重要

3．4 Zic2影响OCT4信号

3．5 Zic2结合到OCT4的promoter上

3．6 Zic2招募NURF复合物

3．7 NURF复合物对肝癌干细胞的干性维持不可或缺

3．8 NURF复合物与肝癌的临床严重性和预后有关

第四章 讨论和小结

第三部分 Lnc-p-Catm影响肝癌干细胞的分子机制研究

第一章 文献综述

1．1 Long noncoding RNA

1．2 Wnt／β-catenin

1．3 EZH2

1．4 蛋白质翻译后修饰

第二章 实验材料和方法

2．1 FISH

2．2 RNA EMSA

2．3 Northern

2．4 RNA-IP

2．5 RNA-Pull down

第三章 实验结果及讨论

3．1 Lnc-β-Catm在肝癌中高表达

3．2 Lnc-β-Catm在肝癌干细胞中高表达

3．3 Lnc-β-Catm对肝癌干细胞的自我更新至关重要

3．4 Lnc-β-Catm与β-catenin和EZH2相互作用

3．5 Lnc-β-Catm促进β-catenin和EZH2的相互作用

3．6 EZH2能够甲基化β-catenin

3．7 EZH2甲基化β-catenin的位点是K49

3．8．β-catenin甲基化抑制其磷酸化和泛素化

3．9．Lnc-β-Catm通过β-catenin促进肝癌干细胞的自我更新

3．10．Lnc-β-Catm和Wnt／β-catenin与肝癌临床相关

第四章 讨论和小结

第四部分

第一章 文献综述

1．1 SWI／SNF复合物

1．2 Yap1信号通路

1．3 Klf4

第二章 实验方法

第三章 实验结果及分析

4．1．LncBrm在肝癌中高表达

4．2．LncBrm在肝癌干细胞中高表达

4．3．LncBrm敲低抑制肝癌干细胞的自我更新

4．4．LncBrm高表达促进肝癌肝癌细胞的自我更新

4．5．LncBrm和Brm相互作用

4．6．Brm／Brg1影响Yap1的信号通路的活化

4．7．Yap1信号通路促进肝癌干细胞的自我更新

4．8．Yap信号通路的活化与肝癌临床严重程度密切相关

第四章 讨论和小结

参考文献

博士期间发表论文

致谢