肾纤康通过TGF-β1/Smads信号通路干预肾小管上皮细胞转分化的研究

摘要

目的：　　采用体外培养细胞的方法，观察中药复方肾纤康对转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）刺激大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）转分化的作用，从细胞分子水平探讨肾纤康对肾间质纤维化的作用及其机制。　　方法：　　采用肾纤康及盐酸贝那普利片给大鼠灌胃，每天分灌2次，持续5天。5天后大鼠腹主动脉采血，分离血清，即得相应药物含药血清。体外培养NRK-52E细胞，培养基为含有10％胎牛血清的DMEM/High-glouse培养基。将NRK-52E细胞分为6组：正常对照组（A组，10%正常大鼠血清）、模型组（B组）、低剂量组（C组，2.5%肾纤康含药血清）、中剂量组（D组，5%肾纤康含药血清）、高剂量组（E组，10%肾纤康含药血清）、贝那普利组（F组，10%贝那普利含药血清）。后5组均用10ng/ml的TGF-β1诱导刺激，经药物干预细胞72h后，观察药物对 NRK-52E细胞形态的影响，采用免疫荧光技术检测α-SMA、Smad3、Smad7蛋白的表达情况，Real-time PCR检测α-SMA、TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA的表达水平。　　结果：　　1、正常大鼠血清、肾纤康及盐酸贝那普利含药血清均不影响体外培养的NRK-52 E细胞的正常生长。　　2、细胞形态变化：A组细胞呈多边形或卵圆形，在培养皿上展现出“铺路石”一样的形态；B组很大部分细胞失去原有形态，呈梭形，排列不紧密，局部交织，状似渔网；C组大部分细胞呈梭形，少部分呈“铺路石”状；D组一部分细胞呈卵圆形，另一部分仍为梭形；E组大部分细胞形态仍为卵圆形，少部分细胞形态转变为梭形；F组细胞形态与E组大致相同。　　3、免疫荧光结果：A组中几乎未见α-SMA蛋白表达，少量Smad3蛋白表达在胞浆中，胞核中几乎无Smad3蛋白表达，Smad7蛋白则大量表达在胞浆和胞核中。B组胞浆中可见大量α-SMA蛋白表达，Smad3蛋白在胞浆、胞核中表达均较A组明显增加，而Smad7蛋白的表达与A组比较则明显减少。与B组比较，C组、D组、E组中α-SMA、Smad3蛋白表达均随着肾纤康剂量的递增而减少，Smad7蛋白的表达则随肾纤康剂量的递增而增加；F组中可见少部分α-SMA、Smad3蛋白表达，同时可见大部分Smad7蛋白表达。其中E组α-SMA、Smad3、Smad7的表达情况与F组大致相同。　　4、Real-time PCR结果：A组少量α-SMA、TGF-β1、Smad3 m RNA和大量Smad7 mRNA表达；与A组比较，B组α-SMA、TGF-β1、Smad3 m RNA的表达量增加（P＜0.05），Smad7 m RNA的表达量减少（P＜0.05）；与B组相比，C组、D组、E组、F组TGF-β1、α-SMA、Smad3 m RNA的表达量均有所减少（P＜0.05），Smad7 m RNA的表达量均有所增加（P＜0.05），且这种变化在肾纤康各剂量组呈现出剂量依赖性的变化趋势。　　结论：　　1.肾纤康含药血清不影响NRK-52E细胞的正常生长。　　2.TGF-β1可刺激NRK-52E细胞转分化，上调TGF-β1、α-SMA、Smad3的表达，下调Smad7的表达，激活TGF-β1/Smads通路。　　3.肾纤康可以抑制NRK-52E细胞转分化，其机制可能与其降低TGF-β1、α-SMA、Smad3的表达，增加Smad7的表达从而阻断TGF-β1/Smads信号通路有关。

目录

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 实验方法与步骤

结果

1、正常大鼠血清、肾纤康及贝那普利含药血清对 NRK-52E细胞的影响

2、肾纤康含药血清对TGF-β1诱导的NRK-52E细胞一般形态的影响

3、肾纤康对TGF-β1/Smad信号通路的影响

讨论

1、肾小管上皮细胞转分化与肾间质纤维化

2、TGF-β1/Smads信号通路与肾小管上皮细胞转分化过程的关系

3、含药血清的制备与选择

4、阳性对照药物贝那普利的选择依据

5、肾纤康立法分析

6、肾纤康对TGF-β1/Smads通路介导的肾间质纤维化的调控作用

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综述：中医药干预肾纤维化TGF-β1/Smad信号转导通路的体外研究概况

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